血红素氧合酶-1对大鼠脑外伤后细胞凋亡的影响

刘中洪，冯家龙，蒋 涛，冉春雷

(武警重庆市总队医院神经外科，重庆 400061)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)对神经细胞的损伤分原发性和继发性两种，细胞凋亡是继发性损伤的一种重要细胞死亡方式，它是由一系列基因控制的迟发性神经元死亡，对继发性脑损伤起着重要的作用，并直接影响TBI的预后。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血红素代谢的一个关键酶及限速酶，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及神经保护作用。为深入研究HO-1对脑外伤后脑组织的保护作用，本实验观察大鼠脑外伤HO-1对神经细胞凋亡是否有抑制作用，以期为临床颅脑外伤开辟新的治疗途径。

1 材料与方法

1.1材料 血晶素(hemin)、锌原卟啉(ZnPP)购自Sigma公司，牙托粉、牙托水、多聚甲醛等常规试剂购自重庆试剂公司，兔抗HO-1(1抗)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)(1抗)、ABC试剂盒均购自南京博士德生物公司。TUNEL法凋亡检测试剂盒购于Boehringer公司，液压伤模型采用Dixon装置。

1.2方法

1.2.1复制动物模型及取材 实验动物及分组：72只雄性SD大鼠购自第三军医大学实验动物中心，体质量280～300 g，采用随机数字表完全随机分为血晶素组、生理盐水组和锌原卟啉组各24只，然后再将每组动物又随机分为灌注组和非灌注组。采用液压伤复制脑外伤动物模型，动物致伤后按45 mg/100 mg体质量腹腔注射血晶素，生理盐水和锌原卟啉按同样量注射。伤后每天注射1次，喂养72 h后处死。切取以损伤灶为中心前后5 mm的大脑冠状切面，固定24 h后，做冰冻切片行SP免疫组织化学及TUNEL染色。

1.2.2脑组织免疫组织化学检测HO-1和Bcl-2的表达 灌注组取标本前进行脑灌注固定，断头取脑组织，继续在4%多聚甲醛中固定6 h以上。然后在30%的蔗糖多聚甲醛液里脱水。作冰冻切片进行免疫组织化学观察HO-1和Bcl-2的表达情况，具体操作按试剂盒说明进行。每只动物观察受伤周围5个视野，计数阳性细胞，然后求平均值，作为每个动物的HO-1和Bcl-2阳性细胞数。

1.2.3神经细胞凋亡检测 按照TUNEL凋亡细胞检测试剂盒说明书操作。细胞核中有绿色荧光者为阳性细胞，即凋亡细胞，每组选5张切片，每张切片在脑损伤侧皮层计数5个不重叠视野，计数100个神经细胞中的凋亡细胞，取平均值，为该切片凋亡指数。

2 结 果

2.1HO-1、Bcl-2的表达和凋亡指数的比较 见表1。

2.2HO-1的表达 通过计数相同视野、相同部位的血红素氧合酶阳性细胞数，结果发现，诱导剂血晶素组血红素氧合酶阳性细胞数较生理盐水组及锌原卟啉组显著增加(P<0.01)。抑制剂锌原卟啉组血红素氧合酶阳性细胞数较生理盐水组显著减少，提示对血红素氧合酶表达的干预比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1 HO-1、Bcl-2的表达和凋亡指数的比较

2.3Bcl-2的表达 通过计数相同视野、相同部位的Bcl-2阳性细胞数，结果发现，诱导剂血晶素组Bcl-2阳性细胞数较生理盐水组及锌原卟啉组显著增加(P<0.01)。抑制剂锌原卟啉组Bcl-2阳性细胞数较生理盐水组显著减少，提示对血红素氧合酶表达的干预后，Bcl-2的表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.4细胞凋亡的检测结果 TUNEL染色见细胞核呈绿色荧光颗粒即凋亡细胞，伤侧大脑皮质即可见凋亡细胞，分布于损伤区及周缘。HO-1诱导组细胞凋亡较生理盐水组及锌原卟啉组显著减少，而HO-1抑制组细胞凋亡较生理盐水组则显著增多，提示对血红素氧合酶表达的干预后，神经细胞的凋亡比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

脑外伤包括一系列病理生理过程，主要是机械损伤、脑水肿、脑缺血、出血等[1]，从而伴随血红蛋白分解和亚铁血红素释放到脑组织细胞外[2]。颅脑创伤所致的神经细胞损伤主要有3种形式：(1)原发性损伤(物理性的打击)所致的神经细胞直接死亡；(2)伤后出血、压迫、缺血缺氧等继发性损伤因素所引起的神经细胞坏死；(3)炎性介质、细胞因子、兴奋性递质、Ca2+超载、氧自由基等因素所诱发的神经细胞凋亡。自1995年美国学者Rink首先证明颅脑创伤后神经细胞存在凋亡现象以来，越来越多的证据表明凋亡在颅脑创伤所引起的神经细胞损伤中起着重要的作用，并对其机制进行了深入的研究。急性颅脑外伤后神经细胞常发生迟发性损伤，主要表现为神经细胞凋亡。夏磊等[3]发现脑外伤后1 h即可出现神经细胞凋亡。细胞凋亡过程受到严格的基因调控。Bcl-2基因是目前公认的内源性抗凋亡因子[4]，它对维持颅脑损伤后神经细胞的生存具有重要作用，并且不同的干预和刺激可上调Bcl-2 mRNA在中枢神经系统的表达及其蛋白合成，抑制神经细胞凋亡，促进轴突再生，从而提高神经细胞的存活能力。其机制可能通过抑制Bax的促凋亡作用、维持细胞钙稳定、抑制细胞色素C进入细胞质等，最终抑制凋亡蛋白酶(caspase)激活所介导的细胞凋亡。研究表明，Bcl-2的表达能抑制多种因素诱导的细胞凋亡，抑制Bcl-2的表达具有促进凋亡的作用[5-6]。HO-1作为亚铁血红素代谢的关键酶，HO-1在细胞抗氧化应激损伤方面起重要调节作用[7-8]。研究表明HO-1不仅能催化血红素生成一氧化碳、铁、胆红素，还具有多种生物活性：抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节微循环的作用[9-11]。同时，HO-1的抗凋亡作用也逐渐成为研究的热点[12-14]。Botros等[12]、Imuta等[13]研究发现HO-1可以降低caspase的活性、促进Bcl-2的表达，从而抑制细胞凋亡。Parfenova等[15]研究也发现，HO-1与原癌基因Bcl-2 和p53家族的激活有关，这些基因的产物在细胞的凋亡中起重要作用。

本课题组采用通过干预HO-1的表达，检测细胞凋亡指数和Bcl-2表达，观察HO-1能否对抗脑外伤后神经细胞凋亡。实验结果提示，脑外伤后HO-1、Bcl-2表达，可以检测大量凋亡细胞。可以发现不同因素的干预HO-1的表达，Bcl-2表达的表达水平随之出现变化，同时改变脑组织凋亡指数，HO-1的表达越高，Bcl-2的表达也越高，大鼠的凋亡指数越低，反之亦然。由此可以推测，外伤后HO-1可能促进Bcl-2表达，从而抑制神经细胞的凋亡，发挥对神经系统的保护作用。同时，在颅脑外伤后，它还可能通过减轻脑水肿、降低脑组织自由基的产生，发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节微循环的作用，从而减少神经细胞凋亡，保护血脑屏障，改善神经行为，最终改善脑损伤的预后。因此，在将来的颅脑外伤治疗中，可以通过改变血红素氧合酶的表达，从而改变颅脑外伤的预后，这将可能为颅脑外伤的治疗提供新的思路。

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