乳鼠耳蜗单离外毛细胞胞膜Prestin分布的实验研究*

张 博，尹时华

(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,南宁 530021)

Prestin是一种特异存在于耳蜗外毛细胞(outer hair cell,OHC)的动力蛋白，该蛋白在解释哺乳动物耳蜗的高度敏感性和频率选择性以及OHC的电动特性机制上具有重要意义。近年来，关于Prestin在OHC的表达、定位以及Prestin与OHC电运动和耳蜗放大效应之间的关系成为研究热点。早期研究认为采用全细胞电压钳技术,在OHC细胞核平面以上的侧膜区域能够记录到与电运动相关的非线性电容，在平面以下的侧膜区域则不能记录到明显的非线性电容，因此，有人推测OHC细胞膜在细胞核平面以下部位无Prestin分布[1-4]。而近年来有人运用荧光双染及复合染色等方法观察发现，Prestin不仅分布于成年大鼠和豚鼠OHC侧膜，在细胞底部也有分布[5]。但有关Prestin在乳鼠耳蜗单离OHC细胞膜上的分布尚未见报道。本研究以Wistar乳鼠为研究对象,观察Prestin在乳鼠耳蜗单离OHC细胞膜上的分布定位。

1 材料与方法

实验动物与OHC的分离:选择出生7 d的Wistar乳鼠20只，雌雄不限，迅速断头，在解剖显微镜下取出耳蜗基底膜。基底膜置于浓度为0.25 mg/mL的木瓜蛋白酶中，37 ℃孵育10～15 min，轻柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液终止消化。悬液经离心后去上清液，加入1 mL培养液在37 ℃，5%CO2孵箱孵育24 h。4%多聚甲醛固定30 min，封闭液(10%山羊血清和1%BSA)30 min，1∶1 000一抗4 ℃过夜，1∶64 FITC兔抗羊IgG二抗(武汉博士德公司生产)室温下孵育1 h，荧光显微镜下观察。

2 结 果

荧光显微镜下显示,经Prestin抗体标记的乳鼠单离OHC的侧膜可见明显的Prestin抗体阳性染色;OHC基底部细胞膜亦见阳性染色,但较弱(图1);侧膜与基底部膜结合部位未见阳性染色。

图1 荧光显微镜下基底部细胞膜部位(箭头所示)

3 讨 论

在耳蜗放大机制中，OHC能够将电信号转化为细胞长度的机械性改变[6]。当外界声音引发耳蜗内液体波动及基底膜机械振动时,内毛细胞和OHC表面的纤毛束可将这种机械刺激转换为电信号。其中OHC电位变化除小部分作为声音信息传入大脑外,大部分都通过引发胞体电运动转化为机械能,并反馈给基底膜,进一步增强基底膜的振动,使内毛细胞感受的机械刺激得以放大[7]。此过程中,OHC电运动成为关键。Prestin作为OHC的运动蛋白,是电运动和耳蜗放大效应的分子基础,并特异性地在耳蜗OHC侧膜上表达,而在耳蜗内毛细胞及心脏、脑、肾脏、肺和肌肉等重要组织中均未发现Prestin表达[8-10]。通过基因敲除动物模型,也进一步证实了Prestin是OHC电运动及耳蜗放大效应所必需的运动蛋白[11]。

近年来，有人运用荧光双染及复合染色等方法观察发现，成年大鼠和豚鼠OHC除了侧膜有明显的Prestin抗体阳性染色之外，在OHC基底部的细胞膜上也有较强的阳性染色，同时在细胞核平面以下的侧膜即侧膜与基底部细胞膜结合处也有阳性染色的存在[5]。

本实验是以出生7 d乳鼠为研究对象,利用Prestin特异性抗体染色，在荧光显微镜下观察Prestin在乳鼠耳蜗单离OHC细胞膜上的表达与分布。本研究结果显示：(1)OHC侧膜存在较为均一的Prestin抗体阳性染色；(2)OHC底端细胞膜亦见阳性染色,但着色较弱；(3)侧膜与底端细胞膜结合部位未见阳性染色。通过本实验的结果可以推测：成年大鼠OHC基底部细胞膜以及细胞核平面以下的侧膜上分布的Prestin蛋白不是一出生就存在的，而是逐步产生增多的。有文献报道了Prestin的表达可被控制,并且在细胞生命周期中处于不间断更新过程中，并推测OHC的基底部可能存在Prestin的储存库[5,12]。从本实验结果来看，储存库可能存在于OHC侧膜，侧膜上的Prestin在耳蜗OHC成熟过程中不断增加，并向基底部膜扩散，这也能比较好地解释成年Wistar大鼠OHC细胞核平面以上的侧膜、基底部膜和细胞核平面以下的侧膜上Prestin密度逐渐减少这一现象。

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