实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

毛文捷，邹盛华，张丽水，黄明翔，戴腊梅（福建省福州市肺科医院 350008）

实时荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）技术于1996年由美国应用生物（Applied Biosystems）公司推出，较常规PCR（end－point PCR）不同，可在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。本院于2007年从美国Applied Biosystems公司引进该技术，应用于结核病的临床诊断。本研究对189例临床诊断肺结核患者的痰液进行FQ－PCR检测、BACTEC 960培养和涂片抗酸染色，并对结果进行对比分析，探讨FQ－PCR在肺结核诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2010年1月至2010年3月住院的经细菌学确诊的肺结核患者189例，其中男102例，女87例，年龄18～75岁，平均33.8岁。其他肺部疾病患者94例，其中肺炎19例，非结核分枝杆菌肺病20例，支气管扩张24例，肺癌31例。另取门诊健康体检者20例作为对照组，其中男女各10例，年龄20～55岁。

1.2 仪器与试剂 美国应用生物（Applied Biosystems）公司生产的ABI7300荧光定量扩增仪，结核分枝杆菌核酸扩增PCR荧光检测试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司生产，美国BD公司BACTEC 960全自动分枝杆菌检测仪及配套试剂，奥林巴斯显微镜，抗酸染色液（自制）。质控菌株：结核分枝杆菌（ATCC27294）。

1.3 方法 189例肺结核患者采集早晨痰液标本3份，分别进行FQ－PCR检测、涂片抗酸染色镜检及BACTEC 960培养。其他肺部疾病患者94例及健康体检者20例采集晨痰标本1份进行A组实验。

1.3.1 PCR检测 （1）痰液中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30min左右液化，取1.0 mL至离心管中，再加入0.5 mL 4%NaOH，室温放置10min后15 000 r／min离心5min。去上清液，沉淀加无菌生理盐水1 mL打匀，15 000 r／min离心5min，再重复一次，沉淀加50μL DNA提取液，置沸水浴10min。10 000 r／min离心5min，取上清液2μL做PCR。取单管单人份PCR反应管若干，加入处理后样品2μL，8 000 r／min离心5 s。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃2min；93℃45 s，55℃120 s，10个循环；置33℃保温，迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A0。荧光激发波长为487 nm，检测波长为525 nm。最后按93℃45 s，55℃120 s，30个循环；置33℃保温。（2）反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（2～4）、stop值（7～9）以及Threshold值，最后到reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的Ct值。（3）结果判定。在实验有效的前提下根据Ct值判定阴阳性，Ct值大于或等于30为阴性，Ct值小于30为阳性。

1.3.2 涂片抗酸染色 所有送检的痰标本严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》操作［1］，每份标本涂片3张，其中只要有1片为阳性即统计为阳性。

1.3.2 BACTEC 960培养 所有送检的痰标本严格按照BACTEC 960操作规程，阴性报告时间设定为42 d。

1.4 统计学处理 使用SPSS13.0进行统计计算，采用χ2检验方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

189例肺结核患者的痰液FQ－PCR检测阳性者123例，BACTEC 960培养阳性者120例，两者同时阳性的为107例，FQ－PCR检测阳性而BACTEC 960培养阴性为16例，PCR检测阴性而BACTEC 960培养阳性为13例。涂片抗酸染色阳性76例，FQ－PCR和BACTEC 960培养均为阳性（表1）。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照FQ－PCR检测均为阴性，特异度为100.0%。

表1 3种方法检测结果对比

3 讨 论

PCR技术是一种先进的基因诊断方法，在肺结核的临床诊断中也得到了广泛应用。但是因为PCR污染问题而导致假阳性率高，一度引起人们的怀疑。自从1996年美国应用生物（Applied Biosystems）公司推出FQ－PCR技术，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR（end－point PCR）相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点［2］。

本研究采用FQ－PCR技术，利用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、4种核苷酸单体（d NTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA，做定量检测，定性报告，使结果更准确。肺结核患者FQ－PCR检测敏感度为65.1%（123／189），94例其他肺部疾病患者及20例健康对照FQ－PCR检测均为阴性，提示特异度为100.0%。

结核病诊断的金标准是检出痰液中的结核分枝杆菌，传统的方法是痰培养发现结核分枝杆菌或痰涂片抗酸染色发现抗酸杆菌，FQ－PCR技术则是检测痰液标本中结核分枝杆菌DNA的含量。FQ－PCR 敏感度最高为 65.1%（123／189），BACTEC 960培养法、涂片抗酸染色分别为63.5%（120／189）和40.2%（76／189）。FQ－PCR与抗酸染色比较差异有统计学意义（χ2＝23.44，P＜0.01），而与BACTEC960培养比较无统计学意义（χ2＝0.10，P＞0.05）。

FQ－PCR直接检测痰液标本中结核分枝杆菌DNA的含量，敏感度和特异度均高，整个过程仅需4～5 h，出报告时间短，可以送检当天出报告，在患者就诊的当天就能确诊，有利于患者的及时诊断和治疗。BACTEC 960培养法敏感度高，但是培养周期较长，不利于结核病的早期发现和早期治疗。李洪敏等［3］报道BACTEC 960培养法初代分离标本阳性报告平均时间为7.2 d，本实验室略长，为8.9 d，阴性报告时间均设定为42 d。痰涂片抗酸染色简单易行，出报告快，费用低廉，可以起到筛查的作用，缺点是阳性率低，易漏诊。

3种方法均要求患者留取合格的痰液标本，以早晨痰液为最佳。操作者应取材恰当，挑取脓液或带血部分，以避免选择唾液部分。BACTEC 960培养要求及时送检，不能及时处理的标本应低温保存。由于BACTEC 960培养前处理的设计缺陷，不可避免导致一定的污染率。穆成等［4］报道BACTEC 960培养污染率为4.95%，高于改良罗氏培养基培养的2.12%。痰涂片抗酸染色也要求及时送检，以避免痰液液化，影响阳性检出率。而FQ－PCR直接检测痰液标本中结核分枝杆菌DNA的含量，关键是DNA的提取过程，尤其是痰液或病理组织样本均质化处理，对于标本送检时间要求不高，不存在污染重送的问题。在结核分枝杆菌DNA提取过程中，为提高阳性检出率，可在加入DNA提取液，置沸水浴10min后，转至4℃静置6～8 h，以保证充分裂解。

FQ－PCR技术因其极为有效可靠，而广泛应用于分子生物学研究各领域。目前已经广泛应用于结核病的临床诊断中。适用于各种临床标本中结核分枝杆菌DNA的直接检测，包含血液标本。而BACTEC 960培养和涂片抗酸染色则不适用于血液标本。黄玮和张永乐［5］报道应用荧光定量PCR检测结核分枝杆菌在支气管灌洗液中检出率最高，其次为痰液，检出率最低为血液。有条件的医院最好在支气管镜下直接从病变的病灶部位取得标本，可以提高检出率。此外，还可用于分枝杆菌菌种快速鉴定及抗结核药耐药基因的快速检测等［6］。

综上所述，作者认为FQ－PCR技术具有快速、准确、特异性强、阳性率高、需时短、缩短了结核菌的检测时间等独特的优点，为结核病的快速诊断提供了更有效的手段，为早期治疗提供有效支持。

［1］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［J］.中国防痨杂志，1996，118（1－3）：30－33，80－85，127－134.

［2］李加平.荧光定量聚合酶链反应在淋巴结结核鉴别诊断中的应用［J］.检验医学与临床，2011，8（1）：67－68.

［3］李洪敏，吴雪琼，王巍，等.新型BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪及其应用［J］.现代科学仪器，2000，16（2）：61－62.

［4］穆成，赵德福，赵慧，等.应用BACTEC 960系统与改良罗氏培养基从肺外标本分离培养分枝杆菌的效果比较［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2579－2580.

［5］黄玮，张永乐.肺结核分枝杆菌在不同标本类型中的分布［J］.医学研究杂志，2009，38（3）：75－76.

［6］白广红，梁雅萍，朱蕾.BACTEC MGIT 960 system快速分离结核杆菌的效果评价［J］.实用医技杂志，2006，13（18）：3187－3188.