毛节缬草抗抑郁和抗肿瘤活性组分的研究

赵丽辉，张一折，杜 娟，韩德明，田 坚，孙秀平

（1.长春理工大学国际纳米光子学与生物光子学联合研究中心，吉林长春 130022；2.郑州大学生物工程系，河南郑州 450001）

毛节缬草抗抑郁和抗肿瘤活性组分的研究

赵丽辉1，张一折2，杜 娟1，韩德明1，田 坚1，孙秀平1

（1.长春理工大学国际纳米光子学与生物光子学联合研究中心，吉林长春 130022；2.郑州大学生物工程系，河南郑州 450001）

对毛节缬草乙醇渗漉提取的浓缩物和药材蒸馏获得的水提液中的活性组分进行了分析.分别加水混悬后，通过小鼠体内实验检测了抗抑郁活性组分；醇提浓缩物加水混悬后用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、浓缩，各萃取组分通过MTT比色法测定了体外培养的Hella细胞、骨髓瘤细胞的增殖抑制率.实验结果表明：缬草水提取物具有抗抑郁的活性，缬草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相对细胞增殖抑制作用均不明显；而提取物的氯仿萃取相抗肿瘤作用明显，且表现出一定的剂量相关性.

缬草；抗肿瘤；抗抑郁；活性组分

缬草（ValerianaofficinalisL.）为败酱科缬草属多年生野生草本植物，多数可作药用，根及根茎是主要入药部位.在中国和欧洲，该属植物具有悠久的药用历史，其成分多种多样，且随着气候及生态环境的不同而有所不同.缬草主要含环烯醚萜、倍半萜、生物碱和黄酮4大类型化学成分［1－2］，其中一种新类型天然产物环烯醚酯类物质，经药理研究表明具有镇静作用，同时还具有细胞毒性和抗肿瘤等多种生物活性［3－4］.本文对缬草的化学组分进行了抗抑郁和抗肿瘤活性组分活性研究，以为制备毒副作用小甚至无毒副作用的新型抗抑郁、抗肿瘤药物提供理论支持.

目前治疗抑郁症、肿瘤的药物服后不仅有不良的反应，还可产生多种危害，长期服用，可引起依赖性和耐受性，有的还具有成瘾性.这就迫切需要尽快开发研制出疗效确切，既能抑郁症、杀伤肿瘤细胞，且毒副作用又小的国产抗抑郁症、抗肿瘤植物药［5］.中药抗抑郁症、抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，可作用于治疗抑郁症、肿瘤发生、发展的多个环节；同时其毒副作用低，能提高机体免疫力，不易产生耐药性，为近年来研究的热点［6－7］.缬草的活性成分也正是我们要筛选的抗抑郁症、抗肿瘤药物之一.

1 实验部分

1.1 材料和试剂

乙醇溶液（95%）购于北京化工厂；PBS液（无钙、镁离子），0.5%胰蛋白酶，3%谷氨酰胺，培养液（RPMI1640＋10%小牛血清），MTT（Sigma，5 mg／m L），甲瓒溶解液（10%十二烷基硫酸钠），吐温80等试剂均购于鼎国生物技术有限公司；安乐片由四川琦云药业有限责任公司出品；Hella细胞、骨髓瘤细胞，本实验室保存.ICR小鼠80只（雌雄各半，体重18～22 g），由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供.

1.2 缬草的提取

首先将缬草根粗粉，用15倍（质量）95%乙醇渗漉提取，收集渗漉液，在78℃以下减压回收乙醇，得膏状物；另取缬草根加水蒸馏5 h，将药渣水相过滤、减压浓缩，得水提浓缩液［8］.

1.3 动物实验

实验选取自主活动次数相近的小鼠80只，随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养.其中：

Ⅰ组为阴性对照组，每日以生理盐水0.02 m L／g灌胃；

Ⅱ组为阳性对照组，每日以抗抑郁药安乐片20 mg／kg灌胃给药；

Ⅲ，Ⅳ组分别以缬草醇提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃给药；

Ⅴ，Ⅵ组分别以缬草水提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃给药；

Ⅶ组以缬草挥发油0.5μL／g灌胃给药.

每个对照组均需另加剂量为10 m L／L的乳化剂吐温80，以利于溶解.连续给药10 d.

1.4 缬草乙醇提取物的萃取

称取缬草乙醇提取物500 g，分3份分别混悬于500 m L水中，分别用适量的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取3次.合并萃取液，用旋转蒸发仪依次回收萃取液，得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃取后剩余水相.

1.5 MTT法

将传代肿瘤细胞悬液离心后，用含10%小牛血清的RPMI1640重悬配成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，收集对数期细胞，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为1 000～10 000个／孔，随即加入不同浓度的待试药液.阳性对照组加入5－氟尿嘧啶（5－Fu），溶剂组加0.9%NaCl溶液，容积均为20μL.培养液中药物终浓度分别为0.05，0.1，0.15，0.02 g／L.37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养5 d后，每孔加入MTT溶液20μL，孵育4 h后每孔加入DMSO 150μL，在酶联免疫检测仪570 nm（630 nm校准）处测量各孔的吸光值（D（570）值）.

配制浓度为5 mg／m L的MTT：称取MTT 0.5 g，溶于100 m L的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，4℃避光保存.用酶标仪检测结果，为了保证实验结果的线性，MTT的吸光度最好在0～0.7范围内，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量［9］.

2 结果与分析

2.1 缬草提取物对小鼠强迫游泳不动时间的影响

动物持续灌胃给药11 d，至第11天时，给药30 min后，将小鼠放入水深为10 cm、高20 cm、直径10 cm的圆柱形玻璃缸中，每缸一只，水温25℃，小鼠游泳2 min后，立即开始观察，观察持续5 min，记录此5 min内小鼠在水中停止挣扎、或呈漂浮状态、或仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间（不动时间），结果见表1.

表1 提取物对小鼠游泳不动时间的影响

表1显示，Ⅲ，Ⅴ与Ⅰ（阴性对照组）比较无显著性差异（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ与Ⅰ比较有显著性差异（P＜0.05）.由此可见，缬草醇提物低剂量组、水提物低剂量组对小鼠强迫游泳不动时间无显著影响；缬草醇提物高剂量组、水提物高剂量组均能缩短小鼠强迫游泳不动时间.

2.2 缬草提取物对小鼠悬尾不动时间的影响

动物灌胃给药12 d，至第12天给药30 min后，测悬尾不动时间：将小鼠尾部后1／3处用铁夹固定，悬吊于铁架台上，使其头部向下悬挂，出现不动时用秒表计时，累计6 min内不动时间，结果见表2.

表2显示，Ⅲ，Ⅴ与Ⅰ（阴性对照组）比较无显著性差异（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ与Ⅰ比较有显著性差异（P＜0.05）.由此可见，缬草醇提物低剂量组、水提物低剂量组对小鼠悬尾不动时间无显著影响；缬草醇提物高剂量组、水提物高剂量组均能缩短小鼠悬尾不动时间.

表2 提取物对小鼠悬尾不动时间的影响

综合表1、表2可知，缬草醇提物高剂量组、水提物高剂量组能缩短小鼠强迫游泳及悬尾不动时间，有抗抑郁作用，具有较大的研究价值.

2.3 缬草乙醇提取物抗肿瘤实验

显微镜下观察，培养后期溶剂组肿瘤细胞活跃增殖，全视野密集均匀分布，5－Fu和醇提氯仿层萃取物的肿瘤细胞明显稀疏，部分细胞破碎坏死，尤以大剂量组为甚.加入MTT后，溶剂组镜下可见大量放射丛状结晶，5－Fu和醇提氯仿层萃取物组的结晶随浓度加大肿瘤细胞明显减少.各试剂组在不同浓度下的光密度值见表3及表4.

表3 MTT比色法测定缬草提取物对Hella细胞的增殖影响

表4 MTT比色法测定缬草提取物对骨髓瘤细胞的增殖影响

从表3可以看出，缬草乙醇提取物氯仿萃取相与溶剂组（阴性对照组）比较有显著性差异（P＜0.05）；缬草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相与溶剂组比较无显著性差异（P＞0.05）；缬草乙醇提取物氯仿萃取相与5－Fu组（阳性对照组）比较无显著性差异（P＞0.05）.可见缬草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗Hella细胞活性.

从表4可以看出，缬草乙醇提取物氯仿萃取相与溶剂组（阴性对照组）比较有显著性差异（P＜0.05）；缬草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相与溶剂组比较无显著性差异（P＞ 0.05）；缬草乙醇提取物氯仿萃取相与5－Fu组（阳性对照组）比较无显著性差异（P＞0.05）.可见缬草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗骨髓瘤细胞活性.

3 讨论

小鼠强迫游泳不动实验和小鼠尾悬吊实验属于行为绝望实验，被广泛用于抗抑郁药的筛选和评价［10－11］.本研究采用了这两种抗抑郁动物模型，以观察缬草乙醇提取物、缬草水提取物对小鼠抑郁状态行为的影响，结果显示缬草醇提物、水提物均不同程度地缩短了小鼠不动时间，其中缬草水提物抗抑郁作用显著.缬草醇提物高剂量组、水提物高剂量组能缩短小鼠强迫游泳及悬尾不动时间，有抗抑郁作用，具有极大的研究价值.

采用MTT比色法［12－13］，以人体宫颈癌细胞、骨髓瘤细胞为靶细胞，对缬草乙醇提取物各萃取相的抑制肿瘤细胞增殖的作用进行了检测，结果显示缬草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取层、正丁醇萃取层和剩余水层对体外培养的宫颈癌细胞、骨髓瘤细胞增殖抑制作用均不明显；氯仿萃取相抗肿瘤作用显著，剂量在0.05～0.20 g／L之间抑制作用明显.

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Studies of activities component of antidepressie and anticancer onValerianaofficinalisL.

ZHAO Li－hui1，ZHANG Yi－zhe2，DU Juan1，HAN De－ming1，TIAN Jian1，SUN Xiu－ping1

（1.International Joint Research Center for Nanophotonics and Biophotonics，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China；2.Bioengineering Department，Zhengzhou University，Zhengzhou 540001，China）

In this report，obtained ethanol concentrate by using percolation，and waterextract by distillation.Add water after suspension，detect antidepressant active component by the mice in vivo.Using chloroform，ethyl acetate，andn－butanol ordinal extraction，ethanol concentrate add water after suspension，get extract and extraction surplus water phase concentrate.Each extraction is determinede on inhibition rate of Hella cells and mylenoma in vitro by MTT colorimetric.The result shows that water extract has antidepressant activity，ethyl acetate extract phase，n－butanol extractphase and surplus water phase of ethanol extractive has not a significant action in inhibition of cell proliferation.The CHCl3extract phase of ethanol extractive is effective with tumor，and it also shows some of the dose correlation.

ValerianaofficinalisL.；anti－tumor；antidepressie；active component

R 284

360·4010

A

1000－1832（2011）03－0122－04

2011－04－12

吉林省科技发展计划项目（20070902－02）.

赵丽辉（1966—），女，博士，教授，主要从事生物化学和分子生物研究.

方 林）