一种植物物证的DNA提取方法

戈文东，裴 黎，倪萍娅，徐小玉，杨雪莹，张 颖

(1．中国人民公安大学，中国 北京 100038;2．公安部物证鉴定中心，中国 北京 100038)

一种植物物证的DNA提取方法

戈文东1，裴 黎2，倪萍娅1，徐小玉2，杨雪莹2，张 颖2

(1．中国人民公安大学，中国 北京 100038;2．公安部物证鉴定中心，中国 北京 100038)

探索从微量植物检材中提取DNA的有效方法，并尝试应用于法庭科学实践。方法:采用优化改良的硅珠法，从10种不同的植物叶子中提取DNA(8种常见植物，2种毒品原植物)。通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及限制性内切酶消化对提取的DNA进行检测;最后以实际案例中的植物检材为研究对象，验证提取方法。结果:通过该方法提取的植物DNA纯度较高，质量较好。PCR扩增的条带清晰、明亮，无杂带。结论:该方法可有效去除次生物质对DNA的干扰，提取的基因组DNA可满足PCR扩增及以PCR为基础的实验需要，可以应用于法庭科学实践。

法庭科学;植物物证;DNA提取

随着科技的发展和进步，非人源生物物证逐渐引起我国法庭科学工作者的关注，而植物物证的分析鉴定就是其中一项比较重要的内容。植物物证的鉴定有形态学方法和分子生物学方法，前者要求检材尽可能完整新鲜，对鉴定人员则要求有专门的植物形态学知识;而基于DNA分析的分子生物学方法则不受此类限制，有很大的优势。

DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性关系到实验的成败。目前有多种DNA提取方法:CTAB法、高盐低PH法、SDS 法，苯酚法和试剂盒法［1～4］以及在此基础上出现的改进优化方法等。但对植物而言，植物的细胞壁，及其体内多酚类，多糖等次生物质的存在严重干扰高质量DNA的提取，而试剂盒法固然可以获得高质量的DNA，但是成本高，不适合进行大规模的提取。因此，我们选取了8种常见植物及2种法庭科学实践中常见的毒品原植物为材料，在硅珠法［5］基础上进行了优化改良，建立了一套经济高效的可用于多种植物微量组织的DNA提取方法，提取的DNA适用于PCR扩增及后续实验分析。

一、材料与方法

(一)材料

竹叶、核桃树叶子、梨树叶子、梧桐树叶子、柿树叶子、柳树叶子、银杏树叶子均采自中国人民公安大学校园内;桃树叶子采自北京植物园。

罂粟叶子、大麻叶子由公安部物证鉴定中心提供。

(二)DNA提取试剂

1M Tris－ Hcl(PH 8．0)、0．5M EDTA(PH 8．0)、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)均购自上海索莱宝生物科技有限公司;λDNA/HindⅢ、DL2000bp DNA Marker:大连TaKaRa公司;2×PCR MasterMix:Promega公司;硅珠:美国sigma公司;酶切反应所用的试剂均为美国NEB公司生产;其余试剂均为国产分析纯。

硅珠溶液:1g硅珠溶于10ml去离子水，静置2h，弃上清，加入10ml去离子水，再静置2h，弃上清，最后加10ml溶解硅珠即可。

表1 DNA提取试剂Table 1 DNA extraction solutions

(三)DNA提取步骤

1．取干叶15mg，加5mgPVP和少量石英砂研磨成粉状转移至1．5mL离心管中。

2．向离心管中加1mL溶液A，震荡离心后弃上清，此步骤可依据需要重复2－3次。

3．加入250μL溶液B，再加45μL溶液C，同时加入 PK(10mg/mL)10μL、DTT(1mol/L)10μL，反复颠倒混匀溶液。70℃水浴30min，期间震荡2－3次。

4．向管中加入 10μL 0．1U/μLRNase，37℃保温5min。

5．向管中加入三分之一体积的溶液 D，冰浴5min，离心转移上清。

6．加 350μL溶液 E，震荡 30s，最大转速离心5min，转移上清液到新的离心管。加600ml溶液F混匀。

7．加50μL硅珠悬浮液，室温静置10min。以5000rpm离心30s，弃上清(小心操作，以防硅珠被洗脱，导致DNA损失)。

8．加1mL溶液 G，震荡洗涤，离心10s弃上清(重复一次)，室温风干硅珠(小心操作，以防硅珠被洗脱，导致DNA损失)。

9．加40μLTE缓冲液震荡，70℃2min洗脱DNA，离心后，转移38μL上清液到新的离心管，上清液可用于PCR扩增及后续实验。

(四)DNA纯度及质量检测

利用紫外分光光度法检测:取1μLDNA样品用ddH2O稀释100倍，在BECKMAN DU600紫外分光光度计下检测DNA的浓度，测定260、280 nm波长下的吸收值，根据A260/A280判断DNA的纯度及浓度。

基因组琼脂糖电泳检测:取提取的DNA样品8μL，加2μL 的溴酚蓝指示剂，0．9%琼脂糖凝胶(含EB)电泳，电泳结果如图1所示。

(五)PCR扩增及产物检测

PCR扩增:采用植物18s通用引物进行扩增(引物序列如表1所示，由上海生工合成)，扩增反应在ABI9700扩增仪上进行，PCR反应总体系为25μL，内含 PCR master mix 12．5μL，正反引物(10mM/L)各0．5μL，去离子水 10．5μL，模板 DNA1μL。PCR 反应循环程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸 2min，共 30个循环;72℃终延伸10min，4℃备检。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测:取扩增产物5μL，加 2μL 的溴酚蓝指示剂，1．2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳，电泳结果如图2所示。

表2 植物18s通用引物序列［6］Table 2 The universal primer sequences of plant 18s［6］

(六)限制性内切酶消化及检测

采用EcoR I和Mse I两种限制性内切酶(酶切反应所用的试剂均为美国NEB公司生产)对6种植物基因组DNA进行双酶切，反应体系混匀离心，置37℃酶切7h后，65℃水浴20min使反应终止。

消化产物琼脂糖凝胶电泳检测:取消化液10μL，加2μL的溴酚蓝指示剂，0．8%琼脂糖凝胶(含EB)电泳，电泳结果如图3所示。

表3 酶切反应体系Table 3 Restriction digest reaction systerm

二、结果与分析

(一)DNA纯度与浓度

在BECKMAN DU 600上测定260、280 nm波长下的吸收值(结果如表4所示)，紫外分光光度仪检测显示:优化硅珠法所提取的DNA，其A260/A280值均大于1．8，说明DNA的纯度较好，杂质去除彻底。

表4 7种不同植物提取的DNA纯度及浓度比较Table 2 The comparison of DNA concentration and purity extracted from 10 different kinds of plant

(二)琼脂糖凝胶电泳检测结果

基因组凝胶电泳结果显示提取的DNA在高分子量区有清晰明亮的主带，拖尾带较少，表明DNA完整，质量较好;点样孔中几乎无杂质残留，表明提取过程中杂质去除干净，DNA纯度较高(图1)。扩增产物在凝胶电泳的结果显示，扩增条带清晰明亮，无杂带及拖尾现象(图2)，表明优化硅珠法提取的DNA非常适用于PCR扩增及以PCR为基础的实验研究。酶切消化产物凝胶电泳结果显示酶切完全彻底，表明该方法提取的DNA可用于植物RFLP、AFLP等分子遗传标记的实验研究。

三、讨论

植物DNA提取是植物分子生物学研究的基础和前提，也是难点和重点，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行各项后续研究所必需的条件和关键。植物由于细胞壁结构的存在及多酚类，多糖等次生物质的影响，使高质量的DNA的提取获得成为一大难题。因此，我们在硅珠法［7］基础上，做了如下优化改良:一是在研磨过程中加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。多酚类物质是植物体内常见的次生物质，极易与 DNA共价结合引起褐变，使 DNA失活［8，9］，PVP 是一种聚合物，它与多酚结合形成一种不溶的络合物，因此也能有效地去除酚类，但必须在研磨前加入，否则效果甚微。二是溶液A的使用，溶液A实际上是一种去除多糖的Buffer。多糖也是植物体内的常见次生物质，也是干扰植物DNA提取的主要物质，要获得高质量的DNA，必须去除多糖。不同的植物因其种类不同，多糖含量也不相同，故可根据所提取的植物不同有选择地使用。三是加入PK和DTT。PK能消化大片段的蛋白分子，使其更容易去除，而DTT也可抑制氧化反应，避免褐化。在加入PK和DTT后仅经过一次酚－氯仿－异戊醇的抽提过程就使A260/A280达到了1．8。四是以硅珠的形式吸附DNA。硅珠在高浓度促溶剂(如碘化钠等)存在下能特异结合DNA［10］。双链的DNA分子一旦被硅珠吸附则以天然状态或部分变性状态(单链)存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂(如50%乙醇)将其洗脱下来。但是，经水溶性缓冲液(如TE)重新水化后，DNA就可以在硅珠上定量回收。硅珠的使用减少了杂质的掺入，并且可依据检材量灵活掌控硅珠用量，在加热洗脱DNA的时候，硅珠受热更均匀，洗脱更彻底，减少了DNA损失，但要引起注意的是在加完硅珠后的一系列操作步骤中，要小心谨慎，防止硅珠的流失，减少DNA的损失。。

传统的植物DNA提取方法多种多样，主流方法主要有 CTAB 法和 SDS 法两种［11，12］，基于这两种方法的改进与优化方案又是多种多样，但都是依据所提取的植物种类的不同而做的有针对性的改良，譬如说，CTAB法更适合于多糖含量高的植物，而SDS法更适合于多酚类含量高的植物等等［13］。然而不论何种方法，所消耗的样本量都比较大，实验周期也较长，而且不同的植物还要做有针对性的选择和优化。我们建立的优化硅珠法，所使用的试剂价格低廉，方便易得，比试剂盒法更经济;操作步骤简单，实验周期为一个半小时左右，省时省力;样本材料消耗少，仅需要15mg便可得到足够的高质量的DNA用于PCR扩增及后续实验，并且该方法适用于多种植物基因组DNA的提取。对于不同的植物可以增加或删减步骤，比如像罂粟和大麻，多糖含量不高，可减少溶液A的洗涤次数或者不洗涤，结果亦不影响后续实验的进行。实验步骤的灵活掌握，使得该方法更为便捷省时。

四、方法应用

(一)案例应用:

以公安部物证中心现有的大麻案例中的检材为研究对象，按上述方法提取基因组DNA，以大麻性别引物进行PCR扩增［14］，产物经ABI3130遗传分析仪进行检测，检测结果如图3所示:

(二)实验应用:

以公安部物证鉴定中心的大麻标本为研究对象，根据参考文献［15］合成STR引物，以提取的大麻基因组DNA为模板进行PCR扩增，产物经ABI3130遗传分析仪进行检测，部分STR检测结果如图4所 示:

五、结论

我们所建立的植物DNA提取方法操作简便快捷，经济高效，能有效去除次生物质对DNA的干扰，适合于多种植物DNA的提取，得到的DNA能满足PCR扩增及其后续实验的分析，在一定程度上可应用于法庭科学实践中的植物物证DNA提取。

［1］［11］［13］周延清，杨清香，张改娜．遗传标记与应用［M］．北京:化学工业出版社，2008．96～103．

［2］裴黎，牛慧媛，毛泽善等．云南大麻DNA的提取及检测初步研究［J］．刑事技术，2008，(5)．

［3］［8］张得钧，高庆波，段义忠等．一种高效提取虎耳草科植物基因组DNA的方法［J］．安徽农业科学，2008，(16)．

［4］［9］［12］易庆平，罗正荣，张青林．植物总基因组 DNA 提取纯化方法综述［J］．安徽农业科学，2007，(25)．

［5］［7］［10］Boom R，Sol C J A，Salimans M M M，et al．Rapid and simple method for purification of nucleic acides［J］．Journal of Clinical Microbiology，1993，28:495 ～503．

［6］程华，周蓬蓬，余龙江等．濒危植物岩黄连叶片中基因组DNA 的提取及分析［J］．时珍国医国药，2006，(9)．

［14］戈文东，徐小玉，涂政等．应用大麻性别检验技术破案两例［J］．法医学杂志，2011，(2)．

［15］Maria A Mendoza，DeEtta K Mills，Hemant Lata，et al．Genetic individualization of Cannabis sativa by a short tandem repeat multiplex system．Anal Bioanal Chem［J］．2009，393:719～726．

DF794

A

1008－2433(2011)06－0121－04

2011－08－28

中国人民公安大学学生科研创新项目资助(11LGS002)的研究成果。

戈文东(1987— )，男，河南驻马店人，中国人民公安大学09级法医专业硕士研究生;裴 黎(1953— )，女，河南新乡人，公安部物证鉴定中心主任法医师，中国人民公安大学法医遗传学硕士生导师，主要从事法医遗传学的研究和教学;倪萍娅(1986—)，女，浙江富阳人，中国人民公安大学2010级法医专业硕士研究生;徐小玉(1983—)，女，江苏启东人，公安部物证鉴定中心主检法医师;杨雪莹(1980—)，女，河北昌黎人，公安部物证鉴定中心主检法医师;张 颖(1978— )，女，河北石家庄人，公安部物证鉴定中心主检法医师。