HPLC－ELSD法测定缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量

任洪发

（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东 肇庆526070）

HPLC－ELSD法测定缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量

任洪发

（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东 肇庆526070）

建立了反相高效液相色谱－蒸发光散射检测法（HPLC－ELSD）测定缬氨酸样品中杂质氨基酸含量的方法。 采用Hypersil BDS C18色谱柱（4．6×250mm，5μm），以0．1%三氟乙酸乙腈溶液－0．1%三氟乙酸水溶液为流动相进行线性梯度洗脱， 流速为0．8mL·min－1， 在漂移管温度60℃， 氮气流量1．5L·min－1的条件下，在25min内完成缬氨酸样品中杂质氨基酸的分离测定。在线性范围内，各组分进样质量的常用对数值与峰面积的常用对数值均呈良好的线性关系。精密度和重复性较好，样品的加样回收率为97．5%～98．0%。该方法检测速度快、检测过程简单方便、检测结果准确可信，可以作为缬氨酸样品中杂质氨基酸含量的检测方法，也为其他原料药中氨基酸的分析提供了参考。

反相高效液相色谱；蒸发光散射检测；氨基酸；缬氨酸

L－缬氨酸含有5个碳原子，支链结构，属于中性氨基酸，是人体必需氨基酸之一。它的用途广泛，在医药工业，作为营养增补剂，主要用以配制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等，在食品工业，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。在饲料工业，用于猪饲料中，对母猪乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。另外，以缬氨酸为原料可以合成缬更昔洛韦、缬沙坦等原料药。缬氨酸的生产主要采用生物发酵法，副生的杂质氨基酸比较多，并且杂质氨基酸结构与缬氨酸相近，难以除去。因此，在缬氨酸的菌种选育、发酵调节、提取精制等试验研究［1～3］的过程中，需要对缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量进行监控。研究一种快速、简便、高效的检测杂质氨基酸含量的方法具有重要的意义。

目前，氨基酸的分析方法主要有柱后衍生离子交换色谱法、柱前衍生高效液相色谱法和离子色谱法［4］。衍生法操作繁杂，衍生试剂昂贵，离子色谱法仪器成本高。试验研究中样品成分复杂，检测频率高，需要开发低成本、高效率的检测方法。有文献报道，利用高效液相色谱－蒸发光散射检测法（HPLC－ELSD）检测氨基酸无需衍生，应用范围广，适用于快速测定氨基酸［5～7］。 本文尝试采用HPLC－ELSD法对缬氨酸样品中的杂质氨基酸进行检测。该方法快速、简便，分离效果好，适用于缬氨酸试验研究中杂质氨基酸的快速检测。

1 实验部分

1．1 仪器及试剂

Agilent1200高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器（ELSD）3300，ME215S型电子天平，。

缬氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、三氟乙酸（TFA）、乙腈（色谱纯）、缬氨酸供试样品。

1．2 标准品混合溶液和供试品溶液的制备

分别精密称取丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸标准品各约25 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解，稀释定容，配制成标准品混合液。

精密称取缬氨酸供试样品约100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解，稀释定容，配制成供试样品溶液。

1．3 色谱条件

色谱柱Hypersil BDS C18 4．6×250 mm，5 μm。流动相：（A）0．1%三氟乙酸乙腈溶液；（B）0．1%三氟乙酸水溶液。线性梯度洗脱程序：0～5 min，0%A，20 min时升至40%A，25 min时降至0%A；流速0．8 mL·min-1；柱温35℃。 漂移管温度60℃；氮气流量1．5 L·min-1；进样量20 μL。

2 结果与讨论

2．1 流动相的选择

对比甲醇水溶液与乙腈水溶液的分离效果，甲醇水溶液得到的峰形比较差，部分组分没有完全分离，乙腈水溶液分离效果稍好，各峰基线分离，少量拖尾。在水相中加入三氟乙酸后分离效果明显改善，因为需要采用梯度洗脱，同时在溶剂相中也加入三氟乙酸后分离效果更佳。对两相中 加 入 三 氟 乙 酸 的 量 （0．05%、0．10%，0．15%，0．20%）进行了考察，结果表明，三氟乙酸的浓度对峰形有影响，采用0．1%浓度的三氟乙酸效果较佳。各峰基线分离，峰形尖锐，对称性良好。因此，选择两相中加入0．1%浓度的三氟乙酸进行检测试验。

各种氨基酸的保留时间差别比较大，要同时分析几种氨基酸的含量，需要进行梯度洗脱，在保证分离效果的情况下进行梯度洗脱减少分析时间。在上述流动相研究的基础上，试验了不同梯度洗脱条件对分离效果的影响。在前面色谱条件中所述的线性梯度洗脱程序下，在25 min内可以同时检出缬氨酸样品中的杂质氨基酸成分。

2．2 检测器参数的选择

蒸发光散射检测器的检测包括雾化、蒸发和检测三个步骤。漂移管温度和气体流量是影响检测结果的重要因素。漂移管温度越高，流动相越容易蒸发，温度过低会导致流动相蒸发不完全，基线噪音大。气体流量越大，形成的气溶胶越小，灵敏度降低。因此，需要选择合适的漂移管温度和气体流量。ELSD3300中安装有撞击器，只有部分气溶胶通过漂移管进入到光散射检测池被检测。本研究中考察了漂移管温度（40，50，60，70，80，90℃）和氮气流量（1．0，1．5，2．0，2．5 L·min-1）对检测结果的影响，结果表明，在漂移管温度60℃，氮气流量1．5 L·min-1时，基线平直，噪音小，灵敏度高。 因此，选择漂移管温度60℃，氮气流量1．5 L·min-1进行检测。

2．3 线性关系考察

精密吸取标准品混合液0．5，2，4，6，8，10 mL分别置于100 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，各取20 μL进样。按照上述色谱和检测器条件进行检测，以各氨基酸组分峰面积的常用对数值Y为纵坐标，以各氨基酸组分进样质量的常用对数值X为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。在上述线性范围内，各组分进样质量的常用对数值与峰面积的常用对数值均呈良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果Tab1 The results of linear test

2．4 精密度和重复性试验

精密吸取标准品混合液4 mL置于100 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，取20μL进样。按照上述色谱和检测器条件进行检测，连续进样5次，测得各组分色谱峰保留时间波动为小于0．3 min，峰面积相对标准偏差（RSD）为0．36%～1．92%。说明检测方法精密度较好。

取同一批缬氨酸供试样品，按照供试品溶液制备方法平行制备5份样品，分别进样20μL。精密吸取不同体积的标准品混合液置于100mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，取20μL进样。按外标两点对数方程法计算含量的相对标准偏差（RSD），结果为0．65%～2．06%。 说明检测方法重复性良好。

2．5 回收率试验

精密称取缬氨酸供试样品约100 mg，置于容量瓶中，加入适量的氨基酸标准品混合溶液，按照供试品溶液的配制方法进行溶液配制，在上述色谱和检测器条件下进行检测，结果见表2。说明检测方法回收率比较好。

表2 缬氨酸供试样品中丙氨酸和亮氨酸的加样回收率（n=3）Tab2 Recoverles of alanine and leucine added（n=3 ）

2．6 样品分析

取同一批缬氨酸供试样品，按照供试品溶液制备方法平行制备3份样品，分别进样20 μL。精密吸取不同体积的标准品混合液置于100 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，取20 μL进样。在上述色谱和检测器条件下进行检测，按外标两点对数方程法计算含量。HPLC－ELSD色谱图见图1，含量检测结果见表3。缬氨酸供试样品中主要杂质氨基酸为丙氨酸和亮氨酸。

图1 缬氨酸供试样品HPLC－ELSD色谱图Fig.1 Chromatogram of a solution of valine products

表3 缬氨酸供试样品中丙氨酸和亮氨酸的含量（n=3）Tab3 The results of analysis for alanine and leucine in valine products（n=3 ）

3 结论

本研究对缬氨酸样品中的主要杂质氨基酸丙氨酸和亮氨酸的含量进行了分析。由于缬氨酸中丙氨酸和亮氨酸杂质难以通过简单处理除去，因此，主要研究了缬氨酸中杂质氨基酸丙氨酸和亮氨酸的含量检测方法。其它杂质氨基酸的检测方法可以参考本研究进行试验。高效液相色谱－蒸发光散射检测器联用检测氨基酸的方法，样品不需要衍生化就可以直接进样分析，简化了样品的前处理过程，减小了检测误差，结果更加准确可靠。该方法可以用于试验研究中发酵液、中间滤液和粗品等缬氨酸样品的质量控制。

［1］ 王平，何英，贺小伟，等．L-缬氨酸菌种的选育及其发酵条件 ［J］．大连轻工业学院学报，2002，21（2）：116-119．

［2］ 陈刚，王开国，浦军平，等．改进L-缬氨酸发酵工艺的实验研究［J］．大连轻工业学院学报，2003，22（1）：41-43．

［3］ 秦永锋，徐庆阳，谢希贤，等．柠檬酸钠对L-缬氨酸发酵及代谢流量分布的影响 ［J］．天津科技大学学报，2010，25（2）：10-12．

［4］ 于泓，牟世芬．缬氨酸产品中微量氨基酸杂质的高效阴离子交换色谱－积分脉冲安培测定［J］．分析测试学报，2007，26（6）：862-865．

［5］ 鄢丹，韩玉梅，董小萍．反相高效液相色谱－蒸发光散射检测法同时测定阿胶中的17种未衍生氨基酸［J］．色谱，2006，24（4）：359-362．

［6］ 鄢丹，张毅，韩玉梅，等．HPLC－ELSD法测定疏血通注射液中17种未衍生氨基酸含量 ［J］．药物分析杂志，2007，27（4）：558-560．

［7］ 陈鼎雄，林立．HPLC－ELSD法测定复方氨基酸注射液（3AA）中三组分的含量［J］．药物分析杂志，2007，27（10）：1649-1651．

Determination of Amino Acid Impurities in Valine Samples by HPLC－ELSD

REN Hong-fa
（Star Lake Bioscience Co．，Inc．，of Zhaoqing Guangdong，Zhaoqing 526070，China）

An analytical method to determine amino acid impurities in valine samples was established by reversed-phase high performance liquid chromatography（HPLC）coupled with evaporative light-scattering detection（ELSD）．A hypersil BDS C18 column was used with the mobile phase of 0．1%trifluoroacetic acid acetonitrile solution-0．1%trifluoroacetic acid solution．Under the condition of solvent gradient elution，the detection was performed at the drift tube temperature of 60℃and the nitrogen flow rate of 1．5 L／min．The flow rate was 0．8 mL／min．The amino acid impurities were separated in 25min．The calibration curves were showed good linearity in the linear range．The experimental results showed that the method had good precision and repeatability，the recovery was 97．5%～98．0%．The method was simple and rapid．The determined results were accurate and reliable．

reversed-phase high performance liquid chromatography；evaporative light-scattering detection；amino acid；valine

O 657．31

A

1671-9905（2011）06-0038-03

任洪发（1976-），男，湖北嘉鱼人，工程师，主要从事食品添加剂和医药原料药的合成研究及管理工作

2011-03-23