长期递增负荷跑台对大鼠骨髓Pro B细胞、Pre B细胞发育的影响

耿青青，郝选明

(1.山东体育学院基础理论系，山东济南 250102;2.华南师范大学体育科学学院，广东广州 510631)

长期递增负荷跑台对大鼠骨髓Pro B细胞、Pre B细胞发育的影响

耿青青1，郝选明2

(1.山东体育学院基础理论系，山东济南 250102;2.华南师范大学体育科学学院，广东广州 510631)

目的:探讨运动性免疫失衡对骨髓B细胞分化、发育的影响。方法:SPF级雄性SD大鼠128只，随机分成绝对安静组(Absolute control，C)组，运动前安静组(Control，A)、运动后即刻组(Immediate，I)、运动后 3h 组(3 Hours，3H)，进行6周递增负荷跑台运动，分别在第0、2、4、6周用流式细胞术检测其骨髓中Pro B、Pre B细胞数量及凋亡率。结果:六周递增负荷运动过程中，在第0周pro B、pre B细胞数量及凋亡率均没有显著性变化。第2周J组，pro B数量呈显著性下降(P＜0.05)，pre B呈非常显著性下降(P＜0.01)，3H组基本恢复到A组(P＞0.05)。4周J组、6周J组pro B、pre B呈显著性下降(P＜0.05)，3H组基本恢复到A组，而同一时相的凋亡率变化则呈相反趋势。结论:提示六周递增运动过程中，机体根据运动需要，通过改变凋亡率，进而改变早期发育中B细胞的数量百分比，以求尽可能维持免疫稳态;并发现pre B细胞对运动负荷更敏感，易受运动的刺激而发生凋亡，细胞数量百分比显著性下降。

B淋巴细胞;发育;细胞凋亡;骨髓;运动性免疫失衡

本研究在前期工作的基础上，利用运动性免疫失衡动物跑台模型大鼠为研究对象，讨论运动性免疫失衡对骨髓B细胞分化、发育的影响，为运动员疲劳诊断和防治提供理论依据。

1 研究对象、动物分组、运动方案和方法

1.1 研究对象、动物分组及运动方案

1.1.1 研究对象及动物分组

SPF级雄性SD大鼠(8周龄，体重130－150 g)128只，随机分为实验组(96只)和对照组(即绝对安静组，32只)，每组8只，共16组。

1.1.2 运动方案

参照郝选明等的通过反复实验性探索获得的运动性免疫失衡发生、发展的动物模型［1，2］:模拟运动训练安排－－长时间、大强度且负荷递增。

低强度适应性运动(10 m/min)训练1周后，负荷递增至20 m/min。随后，每周递增负荷增量5 m/min。至第6周，达到40 m/min，基本达到大鼠最大负荷强度。随运动负荷逐步加大，免疫功能无法完全恢复，形成越来越明显的运动性免疫失衡现象。研究证实此运动模型比较成功。

1.2 取材时间、骨髓单细胞悬液制备、流式染色步骤

1.2.1 取材时间

第0周末即尚未运动训练前，完成一个定量运动负荷(10 m/min，30 min)，分别在运动前安静状态、运动后即刻、运动后3小时，无菌取骨髓和脾脏。随后分别于第2、4、6周最后一次训练完成后48小时测试取样。取样日进行与上周相同负荷的跑台运动，分别在运动前安静状态、运动后即刻、运动后3小时，无菌取大鼠股骨骨髓。

绝对安静组(对照组)32只，正常喂养，不运动，分别于第0、2、4、6周末处死，测试相同指标，用于判别大鼠生长对这些指标的影响。

1.2.2 流式细胞术

于大鼠股骨抽取骨髓;制备新鲜骨髓单细胞悬液，对细胞计数，将细胞浓度调至5×106/ml。骨髓中两个亚群的表型分别为:Pro－B cell:CD45RA+(CD43+IgM－);Pre－ B cell:CD45RA+(CD43－IgM－);采用直接染色法，上流式细胞仪FACS Calibu上收集并进行表型分析。

1.3 数据处理

所有数值均以(x±SD)表示，SPSS17.0统计分析软件完成，两组间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平为P＜0.05，非常显著性差异水平为P＜0.01。

2 研究结果

2.1 六周递增负荷运动中pro B，pre B细胞数量百分比及凋亡率的流式测定

图1 流式细胞术测定结果图

2.2 六周生长发育对大鼠pro B、pre B细胞数量百分比及凋亡率的影响

为了观察六周生长发育对大鼠pro B、pre B细胞数量百分比及凋亡率的影响，实验设计了第0、2、4、6周的绝对安静组(对照组)。统计结果显示(见表3，4，5，6)，六周生长发育对大鼠pro B、pre B细胞数量百分比及凋亡率的影响无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 六周递增跑台运动中大鼠骨髓Pro B、Pre B细胞数量百分比变化

表1 Pro B细胞在骨髓细胞中的数量百分比(%)

表2 Pre B细胞在骨髓细胞中的数量百分比(%)

在6周递增负荷运动中，0周:各组间pro B、pre B细胞数均无显著性差异。

2周:与A组比，J组分别呈显著性(P＜0.05)、非常显著性下降(P＜0.01)，3h组均基本恢复到A组水平(P＞0.05);与 J组比，3h组分别呈显著性(P＜0.05)、非常显著性上升(P＜0.01)。

4周:与A组比，J组均呈显著性下降(P＜0.05)，3h组均基本恢复到A组水平;与J组比，3h组均呈显著性上升(P＜0.05)。

6周:与A组比，pro B细胞 J组呈显著性下降(P＜0.05)，3h组基本恢复到A组水平，而 pre B细胞，J组呈显著性下降(P＜0.05)，3h组呈显著性升高(P＜0.05);与J组比，pro B、pre B细胞 3h组呈显著性上升(P ＜0.05)(见表1，2)。

2.4 六周递增负荷运动中骨髓Pro B、Pre B细胞凋亡率的变化

表3 骨髓Pro B细胞在体凋亡率(%)

表4 骨髓Pre B细胞在体凋亡率(%)

在6周递增负荷运动中，0周:各组间pro B、pre B细胞凋亡率均无显著性差异(P＞0.05)。

2周:与A组比，J组pro B凋亡率呈显著性上升(P＜0.05)，3h组有下降趋势(P＞0.05)，而 pre B凋亡率呈非常显著性上升(P＜0.01)，3h组则呈非常显著性下降(P＜0.01);与J组比，胞3h组pro B细呈显著性下降(P＜0.05)，pre B呈非常显著性下降(P＜0.01)。

4周:与A组比，pro B细胞J组呈显著性上升(P＜0.05)，3h组基本恢复到 A组水平(P＞0.05)，pre B细胞J组显著性上升(P＜0.05)，3h组显著性降低(P＜0.05);与J组比，3h组pro B细胞有下降趋势(P＞0.05)，pre B呈非常显著性下降(P＜0.01)

6周:与A组比，J组均呈显著性上升(P＜0.05)，3h组pro B有下降趋势(P＞0.05)，pre B显著性下降(P＜0.05);与 J组比，3h组 pro B有下降趋势(P＞0.05)，pre B呈非常显著性下降(P＜0.01)(表3，4)。

3 讨论与分析

3.1 六周递增负荷运动对pro B、pre B细胞数量的影响

淋巴样干细胞中的一部分在骨髓内继续分化成B细胞，B细胞经过非抗原依赖阶段和抗原依赖发育阶段，前者主要包括前祖B细胞、原B细胞、前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞，此阶段在骨髓中进行。Pro B细胞，进行重链基因重排，当重排成功，开始表达μ链，意味着B细胞发育由pro B成功转化到pre B细胞阶段［3］。

六周递增负荷运动过程中，在WK0，运动并未对骨髓早期B细胞的细胞数量百分比造成明显影响，但从WK2开始，各运动组B淋巴细胞出现较明显波动，表明一次性的短时间运动训练对骨髓几乎没有影响，然而大强度、长时间训练对骨髓早期B细胞发育有较显著的影响。

经过长期的运动训练，骨髓pro B、pre B的细胞数量百分比变化显著，提示对运动的敏感性提高。WK2 J组，pre B呈非常显著性下降，提示pre B细胞对运动负荷更为敏感，易受运动的刺激而表现为细胞数量急剧减少;应该是机体根据运动需要，通过调节B细胞所占骨髓总细胞的数量百分比，尽力维持免疫稳态。

推测出现这一现象的原因有以下几个方面:一方面是由于运动导致机体骨骼肌炎症反应，进一步促使HSCs向淋系的发育受到抑制，从而出现运动初期各群B细胞计数均减少。

运动训练的骨骼肌适应性改变的发生可能伴随如中性粒细胞和吞噬细胞在肌肉损伤处聚集、骨骼肌白细胞浸润等炎症反应［4］。有研究显示机体发生炎症时，在多种炎性介质诱导下早期造血细胞更倾向于向髓系方向分化，而向淋巴系分化的动力则受到抑制［5］。

提示在运动应激下，机体需要募集更多能量，则通过减少对淋巴细胞的供能，以保护免疫系统的第1道天然防线。

推测另一种可能的原因是由于运动能够影响各群B淋巴细胞的分化成熟的同时，各种应激激素的产生，也诱导早期B细胞的大量凋亡，导致骨髓内各群早期B淋巴细胞计数减少［6］。因此，我们接下来的实验工作观察了六周递增负荷运动对骨髓早期B细胞发育各阶段的细胞凋亡的影响。

此外，六周递增负荷运动对骨髓早期B细胞发育的影响可能还与运动大量耗能，进而减少了骨髓发育中B细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取有关。

3.2 六周递增负荷运动对pro B、pre B细胞凋亡的影响

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程，以凋亡小体形成、染色体DNA断裂、胞膜及核膜皱缩为特征。在免疫系统的发育和功能行使过程中，细胞凋亡始终扮演重要角色，淋巴细胞的分化、成熟乃至死亡过程都伴随着凋亡［3］。

本实验用流式7－AAD染料，不含固定剂的红细胞溶血素处理细胞，染上7－AAD的细胞是中晚期凋亡细胞及坏死细胞。因严格控制实验条件的一致性，可认为各组坏死细胞数相近，故各组的染色细胞的比较，可以认为是凋亡细胞的比较。

Lu L等的研究发现B淋巴细胞在两个发育阶段发生凋亡最为显著［7－9］:一是介于原B细胞与前B细胞之间;二是未成熟B细胞刚开始表达IgM时。原B细胞与前B细胞交界阶段正是前期B细胞进行重链切割和连接的重组阶段。单细胞PCR研究近来证实高达80%的原B细胞不能完成重链重组，因负性选择而凋亡。

以往的体外实验研究发现不同浓度的GC有诱导早期B细胞凋亡的作用，尤其是对 pre－B细胞［10］。Trottier等也报道骨髓早期Pre B细胞对各种凋亡刺激敏感，在应激时常观察到Pre B细胞显著性减少［11］。

六周递增负荷运动过程中，pro、pre细胞凋亡率的变化特征揭示，随着运动负荷的增加和训练时间的延长，应该是机体根据运动需要，通过改变凋亡率，进而改变B细胞所占骨髓总细胞的数量百分比，以求尽可能的维持免疫稳态;并且经过长期的运动训练，pro B、pre B细胞的凋亡率变化显著，对运动的敏感性也提高。

六周递增负荷运动过程中，各早期B细胞亚群，pro B，pre B细胞群凋亡率的增加，可能是运动通过调节早期发育中pro B，pre B细胞膜表面抗凋亡蛋白Bcl－2表达的减少而促成的。胞内Bcl－2/Bax与细胞凋亡和存活密切相关。Bcl－2家族蛋白的表达及活性受细胞内源及外源信号的调节，进而激活Caspase酶，最终导致细胞的降解与凋亡［12］。

流式实验检测到的凋亡的细胞的百分数，其实仅是代表了在一个短暂时刻里可获取的、并且是在体非体外培养状态中的大量凋亡细胞的一小部分，而且是扑捉了在凋亡开始发生与巨噬细胞吞噬状态之时间段内的细胞。流式细胞术测得的早期B细胞在骨髓中的凋亡，只是一个相对的凋亡活动，本身并不能给予一个在体的真实凋亡率［7－9］。因此，今后观测早期B细胞发育在体实验的凋亡率，有待于探索一种更直接的检测方法。

4 小结

5.1 提示六周递增运动过程中，机体根据运动需要，通过改变凋亡率，进而改变早期发育中B细胞的数量百分比，以求尽可能维持免疫稳态，缓解运动性免疫失衡(如细胞免疫的抑制，体液免疫的亢进等);

5.2 经过长期的运动训练，pre B细胞数量百分比呈非常显著性下降，提示pre B细胞对运动负荷更敏感，易受运动的刺激而发生凋亡;

5.3 以往文献多报道长期运动后外周体液免疫呈亢进状态，细胞数量增多但分泌免疫球蛋白功能降低，而我们的研究是早期发育中pro B、pre B细胞数量下降，提示可能是长期运动引发了骨髓B细胞发育中的代偿机制，有待进一步研究证实。

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Effects of Long－term Incremental Exercise on the Development of Pro B cell、Pre B cell in rats Bone M arrow

GENG Qing－qing1，HAO Xuan－ming2

(1.Shandong Institute of Physical Education and Sports，Jinan，Shandong 250102，China)
2.School of Physical Education and Sports Science South China Normal University，Guangzhou 510006，China)

The purpose of this study was to explore the effects of exercise－induced immune imbalance on the development of early precursor B lymphocytes in rats bone marrow.124 Sprague － Dawley rats were randomly assigned to absolute control，control，immediateness and 3 hours after exercises，respectively.The percentage of quantity and apoptosis rate of Pro B、Pre B weremeasurede by flow cytometry at the end of 0 week，2nd，4th and 6th week .The percentage of pro B、pre Bwere no significant changes atWK0A、WK0J、WK03h.As training time increases，WK2，WK4，WK6 show Jgroup was significantly decreased，3h group upward trend compared with A group at the same week.However，the apoptosis rate contrary to the present trend respectively with four stages of the cellmass.Itshowed thataccording to themovement，body changes in the early development of B cell number percentage by changing the apoptosis rate in order tomaintain the immune steady as could as possible.It concluded that pre B cellswere themost sensitive factor ofmovement，appear apoptosis after excise easily and the number of cells decreased.

B lymphocytes;evelopment;apoptosis;bonemarrow;exercise－ induced immune imbalance.

G807

A

1007－323X(2011)05－0101－05

2011－08－10

耿青青(1981－)，女，博士，讲师

研究方向:运动免疫学，运动人体科学

广东省自然科学基金(9151063101000059)