DNA 芯片技术及其应用

张品品，王 恺

（黄河水利职业技术学院，河南 开封 475003）

0 引言

DNA 芯片技术是20 世纪90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是物理学、微电子学与分子生物学综合交叉形成的高新技术[1]。它随着人类基因组计划研究的进展应运而生，但它的应用已不再局限于人类基因组的研究。目前，人类、小鼠、布氏锥虫[2]和恶性疟原虫[3]等多种生物的基因组图谱已经完成， 基因组计划已经进入了功能基因学研究的时期， 充分利用各种基因组图谱资源进行功能基因的研究，成为基因组学研究新的热点。 而DNA 芯片在研究基因的结构和表达中有快速高效的独特优势，使其成为“后基因组时代”基因功能分析研究的最重要技术之一[4]。

1 DNA 芯片技术

DNA 芯片也称DNA 阵列、寡核苷酸阵列等，是生物芯片技术中发展最成熟和最先实现商品化的产品，是基于核酸探针互补杂交技术原理研制而成的。与传统的核酸印记杂交方法相比，DNA 芯片检测技术具有高通量、多参数同步分析、快速全自动分析、高精确度和高灵敏度分析等显著特征[5]。

1.1 DNA 芯片的工作原理

DNA 芯片检测的基本原理是，将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面，制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测DNA 样品进行杂交反应，从而得到我们需要的生物学信息。其工作原理如图1 所示。

1.2 DNA 芯片的制备

图1 DNA 芯片技术的原理Fig.1 DNA chip technology principal

DNA 芯片种类很多，制备方法也不尽相同，但基本上可分为原位合成法和直接点样法两大类。 原位合成法指在固相支持物（如：玻璃、瓷片、聚丙烯膜等）表面原位合成寡核苷酸探针。直接点样法是将预先制备好的寡核苷酸或cDNA 通过自动点样装置点于固相支持物上[6]。与原位合成法相比，它比较简单，多用于制备大片段DNA。原位合成法制备DNA 芯片，主要通过光刻法和压电打印法（也称喷印法）两种途径。光刻法只能用来合成30 nts 左右的寡核苷酸，且每步缩合率较低，约为95%，合成30 nts 寡核苷酸探针的产率仅20%；而压电打印法可以合成40～50 nts左右的寡核苷酸，每步缩合率可达99% 以上，合成30 nts 寡核苷酸探针的产率可达74%，其特异性应比光刻法高。另外，压电打印法制备寡核苷酸探针不需要特殊的合成试剂， 比光刻法具有更高的应用价值。

1.3 样品制备、杂交和检测

对用于制备芯片的DNA 或RNA 样品， 通常要先对其靶序列进行高效而特异的扩增， 待扩增产物纯化后再进行标记。标记可采用放射性标记、生物素标记或荧光标记等不同的方式， 目前多用荧光标记法。 常用的荧光色素有Cy-3、Cy-4 等，也可用双色荧光对不同的样品及对照进行标记。 标记后的样品溶于适量的杂交缓冲液中，配成合适的浓度，然后取适量加于DNA 芯片表面，进行杂交。 杂交反应的条件需根据组成阵列的序列的长度、 芯片的用途等进行优化，不同的杂交强度必须对应不同的序列。如利用DNA 阵列进行多态性分析和测序，必须考虑一个基因中外显子或易突变位点的每一个核酸的位置。 而用DNA 芯片进行基因表达的研究，则无须考虑精确的序列，反应条件相对宽松[7]。

杂交信号的检测是DNA 芯片技术的重要组成部分。杂交信号检测系统主要包括杂交信号的产生、信号的收集及传输、信号处理及成像3 部分。芯片在与荧光标记过的样品杂交后， 经SSC 或SSPE 缓冲液清洗，检测结合于芯片上靶基因的荧光信号，并与对照进行比较，分析处理获得的有关生物信息[8]。 目前， 最常用的芯片检测系统是激光共聚焦荧光检测系统，其主要原理是，与芯片发生杂交的待测样品上的荧光被激发后，经过棱镜聚焦，刚好能通过共聚集小孔，被探测器检测到，而芯片之外的其他荧光信号则不能被检测到。 检测到的荧光信号被计算机处理后， 可直接读出杂交图谱。 此法灵敏度和精确度较高，但是扫描所需时间较长。另一种较常见的检测系统采用CCD 摄像原理， 是以CCD 相机作为信号接收器的。 其特点是，扫描时间短，但灵敏度和分辨率较低。 此外，近年来还产生了多种检测方法，如质谱法、化学发光法和光导纤维法等[9]。

1.4 DNA 芯片结果的分析与验证

DNA 芯片可以在一个实验中同时对几千个基因的表达进行分析，但由于自然的复杂性，产生的数据非常多。从这么多的数据中选择出有意义的数据，并对这些数据进行统计分析， 是非常必要的。DNA 芯片实验数据的统计分析方法一般可分为监督方法和非监督方法。采用监督方法进行数据分析，需要提供一些外部信息，如实验目的及样品来源等。该方法适用于对与处理因素有关的关键基因进行统计分析，从而简洁地对样品进行分类。常用的监督方法有：最近邻法、线性判别分析、分类树法、机器学习法、支持向量机技术等。非监督方法主要是指聚类分析法，包括：自组图分析、系统聚类分析和逐步聚类分析，适用于发现新的基因转录变化。

对DNA 芯片的试验结果，必须用其他技术去证实其准确性。目前验证DNA 芯片反应结果的技术有实时定量PCR 和蛋白质抗体反应，前者的应用实例较多[10]。

2 DNA 芯片技术的应用

DNA 芯片技术本身具有可以对大量的生物样品进行高通量、快速、精确基因分析的特点。 随着研究的不断深入，DNA 芯片制作工艺也不断发展，其应用领域也不断拓宽。

2.1 DNA 测序

将大量已知的核酸探针固化于支持物表面，制成DNA 芯片， 将其与待测DNA 样品的靶序列进行分子杂交，分析产生的杂交图谱，从而确定样品的靶序列， 这一过程称为DNA 测序。 当待测DNA 样品（已经进行了荧光标记）的靶序列与芯片上的核酸探针配对后，就会在DNA 芯片表面留下可检测的荧光斑点，配对的碱基越多，则信号越强。 目前，DNA 芯片主要用于已知序列的重测序[11]。 重测序是指对某一个种群的基因组计划中的基因完成测序后， 由于个体基因组的序列之间存在差异， 需要对个别个体进行再测序。 由于序列已知，由DNA 芯片进行重测序的效率将大大提高。

2.2 食品中病原微生物的检测

细菌污染是最常见的食品污染， 因此食品中病原性细菌的检测是食品安全检测中的一个重要方面。将DNA 芯片技术引入到食品的检测过程，可以大大缩短检测时间， 使一些不能培养或很难培养的细菌也可以得到精确、高效的检测。在实际操作过程中， 会出现有的食品样本成分比较复杂或其中致病菌含量较少的情况，这时DNA 芯片检测的灵敏度会受到影响。 针对这种情况，要将样本中待测DNA 片段的靶序列通过PCR 进行特异性的扩增，从而提高芯片检测微量致病菌的灵敏度。

由于食品样本中可能包含多种致病菌，一个芯片能否同时检测多种病原微生物， 成了新的研究方向。 Hong[12]等设计了基于23SrRNA 的寡核苷酸芯片， 可同时检测食品中的14 种致病菌。 将这种芯片与23SrRNA 的PCR 扩增联合使用，检测精度可达到10CFU/ml 的水平。 Wilson[13]等设计了一个多病原体检测芯片， 可以同时检测18 种病原体。这些利用芯片检测病原微生物研究的成果， 使芯片技术在食品安全检测领域的应用进入了一个新的阶段。

2.3 药物研究和开发

高通量的数据让研究者可以从一个比较全面的角度对药物及疾病的多种参数进行研究，替代了传统药物筛选的复杂方法。DNA 芯片还可以通过检测药物作用对生物体内基因表达水平的影响，获知药物的分子机制和药物对不同生物途径的作用，以便更好控制药物的使用。 目前，DNA 芯片技术正逐步成为药物研发的一个重要手段。

2.4 疾病诊断

人类的许多疾病与遗传基因密切相关，细胞内基因的突变及细胞间基因表达的差异，往往能反映出这些细胞发育是否正常。 在任何一个细胞中，都有成千上万的基因在表达，这就要求有同时能平行地检测这些突变及各种基因表达差异的有效方法。DNA 芯片技术能很好地满足这种要求。 利用DNA芯片技术，可对疾病进行快速、简便、高效、准确的分析。 目前，利用DNA 芯片进行诊断的疾病主要有传染性疾病、 遗传性疾病、 肿瘤和药物代谢疾病4类。 如用于肿瘤的早期诊断及肿瘤易感性的判断P53 基因芯片，检验HIV 的芯片及有无药物代谢缺乏症的CytP450 芯片等。

2.5 环境微生物群落研究

环境样品由多种生物组成，且化学成分复杂，是一种十分复杂的体系，具有菌群结构多样、菌群功能复杂的特点。 DNA 芯片技术的发展，为环境样品的分析研究提供了全新的方法。 DeSantis 等[14]利用含297 851 个16S rDNA 探针的高密度芯片对3种环境样品（水、土壤、气溶胶）的微生物种类进行了分析，并与传统的测序方法进行了比较。 结果表明，芯片技术虽然不能鉴定新菌种，但在分析环境样品时， 能比克隆测序方法获得更多的生物多样性。Palmer 等[15]制备了由10 462 个SSU rDNA 探针组成的DNA 芯片， 并优化了其操作过程。 结果表明，利用该芯片及其操作方法可以对多种环境样品的微生物种类及数量进行全面了解。

3 结语

DNA 芯片技术由于具有高通量、 高灵敏度、检测效率高和对样品需要量少等优点，已成为各领域科学家们关注的焦点。 随着生物信息学的进步和发展，DNA 芯片技术将会进一步成熟， 从而帮助人们认识、掌握和利用生命科学的规律，给我们的生活提供越来越多的方便。 目前DNA 芯片技术还存在一些亟待解决的问题。 例如，在芯片表面原位合成核酸探针时，难免发生错误或混入杂质，造成杂交特异性降低；可查的DNA 片段序列还只是少数，仍有大量的基因片段未被准确测序或尚未公开，使DNA芯片技术难以在更大的范围内使用。另外，昂贵的设备也是制约DNA 芯片技术发展的一大问题，如购买如激光共聚焦显微镜、DNA 合成仪和制造光刻膜等，都需付出很高的费用。

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