八角和丁香提取方法对NDMA阻断效果的影响

王浩田 ，尹立辉 ，马俪珍 ，*，张健斌

（1.天津农学院食品科学系，天津 300384；2.天津农学院基础科学系，天津 300384）

八角和丁香提取方法对NDMA阻断效果的影响

王浩田1，尹立辉2，马俪珍1，*，张健斌1

（1.天津农学院食品科学系，天津 300384；2.天津农学院基础科学系，天津 300384）

采用体外模拟亚硝化反应的条件，优选对二甲基亚硝胺(NDMA)阻断效果较强的香辛料提取液的提取方法。实验选用干燥的八角果实和丁香花蕾为原料，利用水浸提法、索氏提取法、超声-微波辅助溶剂萃取法得到了这2种香辛料的水溶物和精油成分。结果表明：采用水浸提法得到的八角水溶物对NDMA的抑制效果较弱，而丁香水溶物则对NDMA的产生没有抑制作用；采用索氏提取法得到的八角和丁香精油成分对NDMA均有较高的抑制作用。在3种方法中，超声-微波法提取的物质抑制作用最强，利用正交方法得到两种精油对NDMA的阻断效果最佳提取条件为：八角在料液比为1:25（g/mL）、60℃下浸取20 min可使抑制率达到80.32%，丁香利用1:25（g/mL）的料液比，在60℃下浸取30min可使抑制率达到79.45%。

NDMA；八角；丁香；超声-微波；阻断效果

亚硝酸盐在肉品工业中很重要，它在肉腌制时加入使得肉品能产生诱人的粉红色，对肉品的质构、风味都有一定的积极影响，同时它还是起到重要的防腐作用，对肉毒梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用，能抑制其产生毒素，保证肉制品的安全。若腌腊肉制品不使用硝酸盐或过分降低其使用量,则可能会有更大的危险。从1956年～1978年欧共体国家报告了250起肉毒梭菌中毒事件，影响到1850人，其中死亡377人[1]。

到目前为止，在腌肉制品的生产中，还没有更好的发色剂代替硝酸盐。因此，在使用硝酸盐的同时如何抑制和消除亚硝胺的产生则是人们研究的焦点。已知的阻断剂是人们从已有的亚硝酸盐清除剂中选择来的，包括VC及其盐、异抗坏血酸盐、VE等，Mirvish等利用模拟试验肯定了抗坏血酸盐、（异）抗坏血酸盐、VE阻断的效果。从应用角度来看，抗坏血酸盐是水溶性的，在腌肉和腊肠生产过程中添加不能扩散到脂肪中，而从亚硝胺的形成机理和影响因素看，在肉中脂肪是亚硝胺生成和存在的主要场所，抗坏血酸盐在腌肉中的阻断作用肯定会受到影响。VE的溶解性不同于抗坏血酸盐，其脂溶性使得在腌制工艺中如何在肉中均匀地分散成为难题，在香肠伴馅中应用VE可以用醇类来溶解改善，但是在腊肉腌制时VE的应用尚无较好的方法。

近几年来，人们关注的焦点从已知的抗坏血酸（VC）转移到许多种天然植物的提取物质上[2-9]，这些植物的特点是富含VC、类黄酮和酚类等还原性物质。试验结果表明植物中天然成分对亚硝酸钠的清除作用比单纯的抗坏血酸要强，这类试验为降低肉品中的亚硝酸钠残留提供了一定的理论依据，从营养学意义上可以指导人们健康饮食，降低因摄入过多亚硝酸钠带来的危害。

在前期研究几种香辛料对NDMA抑制作用的基础上[10]，发现八角和丁香对NDMA抑制作用好于其它香辛料，本实验试图通过改变香辛料提取方法，来进一步提高八角和丁香浸提液对二甲亚硝胺的阻断效果，实验采用单因素和正交试验方法，分别对水浸提液法、索氏提取法和超声-微波提取法的阻断效果进行研究，以期对实际生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

八角果实、丁香花蕾：购于天津市王顶堤农贸市场；选取干燥纯净、无霉变虫蛀、具有特征香味的原料，用粉碎机粉碎后，过60目筛，制成香辛料粉末备用。色谱纯N-NDMA标准品：深圳迈瑞尔生化试剂公司；色谱纯二氯甲烷：天津科密欧试剂有限公司，使用前用全玻璃仪器重蒸。

1.2 仪器与设备

GC-17A型气相色谱仪：日本岛津公司；DB-WAX型弹性石英毛细管色谱柱：美国J&W SCIENTIFIC公司；KQ-50E超声波清洗仪：上海昆山市超声仪器有限公司；SHA-C型数显式恒温水浴摇床：常州国华电子仪器有限公司；FA1104A型精密电子天平：上海精密科学仪器有限公司；PHS-3BW型酸度计：上海理达仪器厂；CW-2000型超声-微波萃取仪。

1.3 方法

1.3.1 香辛料抑制亚硝胺的模拟试验

参照Narmada等的方法，略有改动。取10 mL的反应缓冲液（2g氯化钠，7mL浓盐酸，定容至1000mL）加入反应试管，再加入一定量的抑制剂，加入1 mol/L的亚硝酸钠溶液1 mL，0.5 mol/L的二甲胺溶液2 mL，充分混合后以重蒸水定容至20 mL。再将反应试管放入37℃水浴中加热1 h，取出后加入3 mL 100 mmol/L氨基磺酸铵溶液和1 mL硫酸溶液（1:3）终止其反应，加入10 mL二氯甲烷，用分液漏斗萃取NDMA，收集二氯甲烷定容至10 mL。然后用气相色谱测定其中NDMA的浓度。

气相色谱的条件：载气：氢气；进样温度：280℃；压力：87.5kPa；总流量：15.8mL/min；吹扫流量：3.0mL/min分流比：50:1；柱箱长：30 mm；内径：0.25 mm；厚度：0.25 mm；分离柱初始温度：50℃，采用二次升温程序。

根据标准NDMA的峰面积和各样品的NDMA的峰面积，可以计算出加入香辛料提取液后同一反应体系所产生的NDMA，以没有加入提取液的空白作对照，所产生的NDMA减去添加有提取液的NDMA的生成量，二者差值除以空白所产生的NDMA的量，就是提取液的抑制率，用百分数来表示。

1.3.2 试验设计

将八角和丁香在40℃下烘干粉碎备用，分别采用索氏提取法、水浸提法、超声-微波辅助萃取法提取出香辛料各种组分，这3种方法提取出的香辛料成分主要包括水溶性成分和精油成分两种。

1.3.2.1 水浸提方法

精确称取10.00 g香辛料干粉，放入250 mL三角瓶中，按照设定的条件充分浸提（时间、温度、料液比），提取液经离心，取上层溶液减压抽滤，在旋转蒸发器中浓缩至浸膏，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。

水浸提选择的单因素为浸提温度、浸提时间和料液比，以最终的定容香辛料醇溶液作为抑制剂，按照1.3.1中描述的方法加入50 mL/1000 mL的提取液考察提取物对亚硝胺的抑制作用，通过对比不同条件下的提取物的抑制作用来选择最佳的提取条件。

1）添加量对抑制作用的影响

添加量选择的水平值包括为3%、5%、7%、9%、11%，均为质量分数，浸提时间为7 h，温度为80℃，测定提取物的抑制效果。

2）浸提时间对抑制作用的影响

选用的浸提时间为 1、3、5、7、9 h，香辛料添加比例为3%、温度定为80℃，测定提取物的抑制效果。

3）浸提温度对抑制作用的影响

选用的浸提温度为 60、65、70、75、80 ℃，香辛料添加比例为7%、浸提时间为5 h，测定提取物的抑制效果。

1.3.2.2 索氏提取方法

精确称取10.00 g香辛料干粉，放入索氏提取器中，用100 mL无水乙醇（或石油醚）提取8 h至提取溶剂无色，提取液用无水乙醇定容至100 mL。对无水乙醇（石油醚）提取物经过离心、减压抽滤后，在旋转蒸发器中回收石油醚，再加入无水乙醇定容至100 mL。

1.3.2.3 超声-微波提取

精密称取10.00 g香辛料干粉，放入250 mL烧瓶中，按照设定的条件（时间、温度、料液比）利用CW-2000型超声-微波萃取仪进行提取，得到的最终溶液处理方法与水浸提法相同。超声-微波选择的单因素和水浸提法的相同，不同的是超声-微波选择的溶剂为石油醚，提取的主要是香辛料中的精油成分，精油在应用前也要先配置成乙醇溶液，这样在模拟反应体系中才能发挥作用。

1）时间对抑制作用的影响

选用的时间为 5、10、15、20、25 min，料液比为1:20、温度恒定为75℃，测定精油醇溶液抑制效果。

2）温度对抑制作用的影响

选用的温度为 55、60、65、70、75 ℃，料液比为1:20，时间为20 min，测定精油醇溶液抑制效果

3）料液比对抑制作用的影响

选用的料液比（g/mL）是 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，温度为75℃，时间为20 min，测定精油醇溶液抑制效果

上述3种方法中香辛料最终均定容为100 mL的醇溶液，而开始称取的香辛料干粉为10 g，因此统一称为10%香辛料提取液。1 mL醇溶液相当于0.1 g香辛料干粉，在每个条件下得到的醇溶液取1mL加入1.3.1介绍的反应体系中考察其抑制效果。

2 结果与分析

2.1 阻断剂提取方法的比较

2.1.1 水浸提液法的试验结果

将水浸提法提取的八角和丁香提取液，在反应体系中添加不同比例，考察浸提时间、浸提温度和添加比例分别对NDMA的阻断效果，结果分别见表1、表2和表3所示。

表1 浸提时间对八角水溶物对亚硝胺的抑制效果的影响Table 1 Effect of extract time on inhibitory of spice watersoluble matter on NDMA

从表1可以看出，在浸提时间达到3h，其抑制率与其他时间相比为最高，达到了28.50%，而随着浸提时间延长，其抑制效果反而降低，到9 h时已经降低至7.16%，说明在水浸提3h时已经将八角的有效成分提取出来。

表2 浸提温度对八角水溶物对亚硝胺的抑制效果的影响Table 2 Effect of extract temperature on inhibitory of spice water-soluble matter on NDMA

从表2可以看出，在浸提温度选择60℃～80℃的范围内，温度上升有助于八角中有机化合物的浸出，但是温度过高也会破坏有机化合物，在本组试验中，温度越高所得到的八角水溶物的抑制效果液越高，在80℃左右抑制率的增长趋势有所减缓，最高抑制率达到了33.84%。

表3 添加量对香辛料水溶物对亚硝胺的抑制效果的影响Table 3 Effect of addition of spice on inhibitory of spice watersoluble matter on NDMA

从表3中可看到，随着八角浸提液的料液比逐渐增大，其抑制效果也随着增大，当达到9%时，抑制率达到最大36.32%，但是当料液比达到11%时，抑制率没有再增大，而是降低到25.63%，可见八角中水溶性成分对亚硝化反应的抑制作用并不是和其含量成正比关系。

丁香和八角的单因素试验条件相同，但从表1、表2和表3中可以看到丁香的水浸提液对NDMA的抑制效果呈现负值，说明丁香水浸提液对亚硝胺生成没有抑制作用，这是试验中所没有预想的，有必要在以后的试验中对丁香的成分进行更深入地分析才能解释这一现象。

从上述3组试验的数据中可以看出，八角中水溶性成分对亚硝化反应的阻断效果并不高，最高在20%～40%之间。若以此法提取八角水提液作为亚硝胺的阻断剂应用于腌腊制品生产，所需要加入的量是非常大的，这对产品的感官质量如质构、风味、色泽等会造成不利影响，因此不选择八角水提液作为亚硝胺的阻断剂。

2.1.2 索氏提取法的试验结果

八角和丁香的索氏提取液对亚硝胺阻断的效果见图1所示。

图1 八角和丁香的索氏提取物对亚硝胺阻断的作用Fig.1 Inhibitory effect of Soxhlet’s extraction of aniseed and clove on NDMA

从图1就可以看出丁香的醇提液的抑制率提高到43%，乙醇溶剂具有特殊性，既具有水溶性，又可以溶解精油类物质，所以乙醇提取的物质成分种类要比水浸提得到的多。用石油醚提取的物质主要是八角和丁香中的精油类物质，对亚硝胺的抑制作用比乙醇提取的还要强。石油醚提取的八角精油的抑制率为57%，丁香精油的抑制率为62%，可见精油类物质比水溶性成分的抑制作用要强。

2.1.3 超声-微波法的试验结果

利用超声-微波法对八角和丁香在萃取时间、温度和料液比单因素试验条件下，所得到的精油对亚硝胺抑制效果分别见图2、图3和图4。

从图2中可以看出，超声-微波结合萃取时间在10 min和20 min下得到的八角精油抑制效果相近，经过15min萃取的抑制作用最强，抑制率达到了67.02%。超声-微波结合萃取的方法比索氏提取的方法所用的时间更短，在不到1 h的时间内就可以得到有很好抑制效果的精油成分。丁香在20 min内的提取精油有最高的抑制率。

图2 萃取时间对八角和丁香精油抑制效果的影响Fig.2 Extraction time on inhibitory effect of aniseed and clove essential oil on NDMA

图3 萃取温度对八角和丁香精油抑制效果的影响Fig.3 Temperature on inhibitory effect of aniseed and clove essential oil on NDMA

从表3可以看出，在60℃时八角精油有最高的抑制率，丁香则在75℃是表现出较高的抑制作用。在60℃以后，随着温度的升高，八角精油的抑制作用又有所增强，但是没有超过60℃时的最高点。

图4 萃取料液比对八角和丁香精油抑制效果的影响Fig.4 Solid to liquid ratio on inhibitory effect of aniseed and clove essential oil on NDMA

从图 4 可以看出，萃取的料液比从 1:10（g/mL）缩小到1:30（g/mL）时，实际操作是固定八角粉的质量，增大石油醚的体积。料液比过大时，溶剂不能有效润湿样品，不足以提出更多精油；而料液比过小，会增加超声微波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低精油的提取率。在八角采用1:25的比例抑制率达到62.28%后，抑制率却没有再增加，而是降低到了50.62%，对于丁香，在采用1:15的料液比后，出现最大抑制率为70.57%。

从上面3种方法的结果比较得出，对NDMA抑制效率最高的方法是超声-微波和索氏提取法，虽然其抑制效果没有达到超临界萃取，但是试验结果表明八角和丁香中的精油类成分是抑制NDMA主要功能性成分，考虑到索氏提取的方法消耗的时间比较长，为了能缩短时间，提高效率，采用了超声-微波辅助提取八角和丁香的精油。并对此法采用正交试验进一步优化条件。

2.2 阻断剂提取方法的优化

根据2.1.3超声-微波辅助单因素试验结果选择正交试验的水平值，如表4和表5所示，通过正交试验优选出八角和丁香超声-微波萃取的最佳条件结果见表6和表7所示。

表4 超声-微波萃取八角精油正交试验Table 4 Orthogonal experiment of extraction of aniseed essential oil by supersonic-microwave

表5 超声-微波萃取丁香精油正交试验Table 5 Orthogonal experiment of extraction of clove essential oil by supersonic-microwave

从表6可以看出，影响八角精油的抑制率的萃取时间、萃取温度、料液比的极差值分别是3.98、20.48和6.14，按照极差分析法可以说明这3个因素对抑制效果的影响顺序分别是萃取温度、料液比和萃取时间，萃取温度对八角精油的抑制效果影响最大，最佳的萃取条件是萃取时间为20 min、萃取温度为60℃、料液比为1:25（g/mL），在上述最佳萃取条件下进行验证试验，得到的八角精油的抑制率为80.32%，比表6中的第二组的抑制效果（该组的抑制率最高，为71.62%）亦高，因此确定此条件为八角超声-微波辅助萃取的最佳条件。

表6 八角精油的正交试验结果Table 6 The result of aniseed essential oil orthogonal experiment

表7 丁香精油的正交试验结果Table 7 The result of clove essential oil orthogonal experiment

从表7可以看出，影响丁香精油抑制率的萃取时间、萃取温度、料液比的极差值分别是5.62、5.32和16.15，按照极差分析法可以说明这3个因素对抑制效果的影响顺序分别是料液比、萃取时间和萃取温度，料液比对丁香精油的抑制效果影响最大，而最佳的萃取条件是时间为30 min、温度为60℃、料液比为1:25（g/mL），通过验证实验，在上述最佳萃取条件下得到的丁香精油的抑制率为79.45%，比表7中的任何组的抑制效果都好，因此确定此条件为丁香超声-微波辅助萃取的最佳条件。

3 讨论

3.1 模拟亚硝化反应的条件

国内的研究者主要是采用紫外光解法[7，9]研究果蔬对亚硝胺生成反应的抑制效果，这个方法对本试验所用的材料不适用，因为本试验中使用的香辛料提取液颜色过深，对NO2-的显色反应有很大的干扰作用。

模拟亚硝化反应的试验条件参考了Narmada等的方法，Narmada的试验方法用于模拟生成亚硝基吡咯烷和亚硝基吗啉，我们考虑到腌腊肉制品中亚硝胺的种类主要为NDMA，所以利用二甲胺盐酸盐提供二甲胺和亚硝酸钠反应，其中反应时间为1 h，温度为37℃，这主要是考虑到亚硝胺的挥发性，时间过长或者温度过高都会影响到亚硝胺的测定。

3.2 香辛料的提取方法

试验中为了能更进一步的分析八角和丁香中的有效阻断成分，分别采用了3种提取方法，得到的产物主要有两种，即水溶性物质和脂溶性物质，其中水溶性物质在中式传统肉品加工中的应用是最广泛的，因为香辛料在传统肉制品中的常作为煮制配方的主要配料，而脂溶性物质主要是精油类成分，精油属于香辛料的深加工产品，其应用还不太普遍。

精油的提取方法有水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法、超临界CO2萃取、超声-微波辅助溶剂提取法，水蒸气蒸馏法是最传统的方法，其效率也较低。超声波提取是利用超声波的空化作用击破植物细胞的细胞壁，从而提高出油率；微波辅助提取，主要是利用微波能，在交频磁场、电场作用下，极性分子取向随电场方向的改变而改变，从而导致了分子的旋转、振动或摆动，加剧反应物分子运动及相互间的碰撞频率，使分子在极短的时间内达到活化状态，分子的剧烈运动导致植物细胞内部结构的破坏，有助于有效成分的溶出，这两种方法结合使用可以大大提高精油的提取效率。2.1.2和2.1.3中两种方法结果比较可以看出，在达到同样抑制效果的情况下，超声-微波法提取时间要比索氏提取法的缩短了很多。

3.3 香辛料中的成分

香辛料中的成分比较复杂，化合物种类很多，同一种香辛料采用不同的提取工艺得到的物质种类含量是不同的，如小茴香的主要成分是大茴香脑（44.66%～68.67%）、油酸（38.30%）、反式大茴香脑（刘娜等）。若用索氏提取器得到的主要成分是大茴香脑，用固相微萃取得到的主要物质是反式茴香脑（77.93%）。从2.1.1和2.1.2中的丁香的试验结果来看，水浸提物和有机溶剂提取物对亚硝化反应作用完全相反，八角的抑制作用也不相同，这些现象都可以说明提取方法对提取物成分的影响。

八角茴香油的主要成分是反式茴香脑（80%以上）、大茴香醛（4%～5%）；丁香的挥发油成分主要是丁香酚和异丁香酚，这两种还原性物质占其中的比例为90%以上；八角茴香油抑制亚硝胺的作用尚未见报道，而丁香酚对NPYR、NPIP和亚硝基吗啉的抑制作用则由Narmada等人证实，本次试验结果表明丁香酚对NDMA的抑制作用很强，这和Narmada等的结果一致[3]。

4 结论

采用水浸提法得到的八角水溶物对NDMA的抑制效果较弱，而丁香水溶物则对NDMA的产生没有抑制作用；采用索氏提取法得到的八角和丁香精油成分对NDMA均有较高的抑制作用。在三种方法中，超声-微波法提取的物质抑制作用最强，利用正交方法得到2种精油对NDMA的阻断效果最佳提取条件为：八角在料液比为 1:25（g/mL）、60 ℃下浸取 20 min 可使抑制率达到 80.32%，丁香利用 1:25的料液比（g/mL），在60℃下浸取30 min可使抑制率达到79.45%。

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Study of Blocking Effect of Aniseed and Clove Extracting Methods on NDMA

WANG Hao-tian1，YIN Li-hui2，MA Li-zhen1,*，ZHANG Jian-bin1
（1.Food Science Department，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.Basic Science Department，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384,China）

In order to optimize extraction methods of spices extracting solution which has effective blocking effect on NDMA,Nitrosation reaction in vitro was carried out.With dry aniseed and clove bud as raw materials,water extraction method,soxhlet extraction method,ultrasonic-microwave assited slovent extraction method were used to obtain water soluble substances and essential oil components.The result showed that the inhibition effect of aniseed water soluble substances extracted by water on NDMA was weaker,while water soluble substances of clove had no inhibition effect on NDMA;the essential oil components of aniseed and clove extracted by soxhlet extraction method had effective inhibition effect on NDMA.The inhibition effect of extracting solution by ultrasonic-microwave extraction method was the strongest.The optimal extraction conditions of two essential oil by orthogonal Method were:the inhibition rete of aniseed was up to 80.32%when extracting for 20 min at the solid-liquid ratio 1:25（g/mL）and at 60 ℃,while inhibition rete of clove was up to 79.45%when extracting for 30 min at the same solid-liquid ratio and temperature.

NDMA;aniseed;clove;ultrasonic-microwave;blocking effect

国家自然基金项目“肉制品加工中蛋白和脂肪氧化与亚硝胺形成的关系研究”（31071568）；天津市科技计划项目“利用天然香辛料生产低亚硝胺含量肉制品的技术应用”（10ZHXHNC07100）

王浩田（1975—），男（汉），讲师，本科，主要从事畜产和水产加工技术研究。

*通信作者：马俪珍（1963—），女，教授，博士，主要从事畜产和水产加工技术研究。

2010-08-12