Caco-2细胞对负载维生素D3的纳米粒的摄入研究

高艳丽，刘 赛

(1.临沂市沂水中心医院临床药学科，山东 沂水 276400;2.青岛大学医学院药理学教研室山东 青岛 266021)

为进一步研究sSAN-FITC负载维生素D3后被Caco-2细胞的摄取情况，本实验采用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)对sSAN-VD3-FITC被Caco-2细胞的摄取进行形态学观察，分析影响摄取的多种因素，使摄取的过程更加直观、可信。

在此基础上采用Caco-2细胞吸收模型对sSANVD3-FITC进行跨膜转运实验研究。因它能为Caco-2细胞提供类似于体内的生长环境，当Caco-2细胞形成单层之后，向肠上皮细胞转化，与小肠上皮细胞结构和功能非常相似，其跨膜转运更加接近体内吸收状况。建立Caco-2细胞模型需要应用Transwell，即跨膜转运装置。它的种类有多种，本实验选用悬挂式、内侧小室底部膜为孔径0.4 μm的聚碳酯膜的Transwell，此种Transwell最适用于药物的跨膜转运研究［1－2］。

跨膜转运实验应用荧光酶标仪检测接受液的荧光强度，定量分析Caco-2细胞对药物的跨膜转运情况，以推测机体对sSAN-VD3的吸收、利用情况，进一步评估应用海藻酸钠经油酸改性后的兼性材料、根据分子自组装原理所制备的纳米粒，作为疏水性营养物质载体的可行性。

1 材料与仪器

1.1 细胞 Caco-2细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。本实验采用30～40代。

1.2 药品与试剂 负载VD3的自组装海藻酸钠纳米粒(sSAN-VD3，食品级，中国海洋大学生命科学部);异硫氰基荧光素(FITC，Amresco 0633，美国);鼠尾胶原蛋白Ⅰ型(杭州生友生物试剂有限公司，批号:20080515);荧光黄(上海埃彼化学试剂有限公司，分析纯，批号:2007-01-02);4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，D212-10型，日本同仁化学研究所中国上海代理处);DMEM高糖培养基(Gibco，美国，批号:1290007);胎牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司，批号:20071127);胰蛋白酶(Sigma，美国);乙二胺四乙酸二钠(EDTA，青岛海泰生物科技有限公司分装，荷兰，超高纯);双抗(青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号:S080148;链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号:070303);曲拉通(Amresco 0694，美国，Cat.No.T8200，试剂级)。

1.3 仪器 荧光酶标仪(M5型，美国分子仪器公司);激光共聚焦显微镜(LSM510-Meta型，德国蔡司公司);Transwell(3401型，美国康宁公司，批号:31907011);Millicell-ERS电阻仪 (MERS00001型，Millipore，美国);CO2培养箱(Heraeus，德国赫利公司);超净工作台(AIR TECH，苏州安泰空气技术有限公司)，倒置显微镜(Olympus，奥林巴斯北京销售)。

2 方法

Caco-2细胞采用DMEM培养基(含10%胎牛血清、双抗)于37℃、5%CO2、相对湿度90%条件下培养至 90%汇合，备用［3－4］。

2.1 共聚焦显微镜下观察Caco-2细胞对sSANVD3-FITC的摄入 调整Caco-2细胞密度至6×107·L－1，接种到细胞爬片上，每孔2 ml，培养至70%汇合。实验前2 h更换无血清、无双抗的培养基。实验前30 min，用37℃Hanks液冲洗细胞3次，在不破坏细胞的前提下，尽量去除细胞表面的杂质［5］。用无血清、无双抗的培养基溶解sSAN-VD3-FITC，设400 mg·L－1浓度组、空白对照组，孵育不同时间(1、4 h)后，用Hanks液冲洗，体积分数为0.75的乙醇固定15 min，再次冲洗。将细胞爬片放置在滴有DAPI的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜观察摄入情况［6］(FITC激发波长为488 nm，发射波长为521 nm;DAPI激发波长为358 nm，发射波长为461 nm)。

2.2 Caco-2细胞吸收模型对sSAN-VD3-FITC的摄入研究

2.2.1 Caco-2细胞吸收模型的建立

2.2.1.1 Transwell转运装置的准备 将 5 g·L－1的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型用0.006 mol·L－1冰醋酸溶液稀释成终浓度为0.0012 g·L－1的溶液，将其加入Transwell内侧小室的聚碳酯膜上［2，7－9］，每孔 200 μl，室温下放置1 h后，用PBS缓冲液冲洗3次。

2.2.1.2 检测跨细胞电阻(TEER) 在 Transwell内、外侧小室分别加入培养基0.5、1.5 ml，用Millicell-ERS电阻仪检测电阻，均在170～185 Ω范围内。

2.2.1.3 接种及培养细胞 细胞接种于Transwell内侧小室内，使细胞在聚碳酯膜上最终密度为7.5×104/cm2［1－2，4，9］，继续培养 21 d。如 Fig 1 所示。

Fig 1 The conceptual diagram of transmembrane transport with Caco-2 cells model

2.2.2 细胞单层完整性检测 培养21 d后，为了确定Caco-2细胞在Transwell内侧小室的聚碳酯膜上是否已生长成一单层连结致密的细胞层，细胞单层是否完整，采用细胞跨膜电阻测量和荧光黄透过实验两种方法进行检测。

2.2.2.1 细胞跨膜电阻(TEER) 用Millicell-ERS电阻仪检测各孔 TEER［3－4，7，9－11］。短电极放到内侧小室，长电极放到外侧小室，检测时不触及内侧小室的底部，以免损坏聚碳酯膜上的Caco-2细胞单层。当细胞单层的电阻＞600 Ω时，表明细胞单层是完整的。

2.2.2.2 荧光黄透过实验 实验前去除细胞表面的杂质［5］。在各孔内侧小室加100 mg·L－1的荧光黄溶液［7，10］0.5 ml，外侧小室加 1.5 ml Hanks 液，培养2 h。用荧光分光光度计检测外侧小室接受液的荧光强度。根据标准曲线确定接受液及原溶液中荧光黄的含量，并计算荧光黄透过率:

当2 h荧光黄透过率＜1%，则说明膜的完整性良好［2］。

2.2.3 sSAN-VD3-FITC跨膜转运实验研究 实验前去除细胞表面的杂质［5］。用培养基溶解sSANVD3-FITC，浓度为 600 mg·L－1。

2.2.3.1 肠腔侧(apica1，AP)-基底侧(basolateral，BL)方向的跨膜转运 设sSAN-VD3-FITC组和空白对照组，每组3个复孔，sSAN-VD3-FITC组在Transwell内侧小室加药0.5 ml，外侧小室加培养基1.5 ml;空白对照组内外侧小室均加培养基。分别于0.5、1、2、4 h 于接受池内取200μl液体，用荧光酶标仪检测荧光强度，并补充200 μl培养基［9］。实验结束后检测各孔的细胞跨膜电阻。

2.2.3.2 BL-AP方向的跨膜转运实验 实验分组同2.2.3.1，sSAN-VD3-FITC组在外侧小室加药1.5 ml，内侧小室加培养基0.5 ml;空白对照组的内外侧小室均加培养基。分别于0.5、1、2、4 h于接受池内取100 μl液体，检测其荧光强度，同时补充 100 μl培养基［9］。实验结束后检测各孔的细胞跨膜电阻。

3 结果

3.1 共聚焦显微镜 如Fig 2～5所示。

3.2 细胞单层完整性检测结果

3.2.1 细胞跨膜电阻(TEER)12孔板的各孔电阻均＞880 Ω，减掉未接种细胞时的电阻后，所测得的各孔的细胞跨膜电阻(TEER)均＞600 Ω，符合跨膜转运实验的要求［3－4，7，10－11］。

3.2.2 荧光黄透过实验 ① 荧光黄直线回归方程为Y=－18.804+926.477X(r=0.9999)测得接受液的荧光强度最高为254.4，2 h最高通过量为0.442 μg，原荧光黄溶液浓度为 100 mg·L－1，按下式计算:

得2 h荧光黄透过率为0.885%，＜1%说明膜的完整性良好，符合跨膜转运实验要求［2］。

3.3 跨膜转运实验结果

3.3.1 AP-BL方向的跨膜转运 与空白对照组相比，sSAN-VD3-FITC在Transwell内侧小室与Caco-2细胞作用不同时间(0.5、1、2、4 h)后，外侧小室内接受液的荧光强度均明显增强(P＜0.05);作用4 h后接受液的荧光强度最强(与作用0.5、1、2 h比较，P＜0.05)。

3.3.2 BL-AP方向的跨膜转运 与空白对照组相比，sSAN-VD3-FITC在Transwell外侧小室与Caco-2细胞作用不同时间(0.5、1、2、4 h)后，内侧小室内接受液的荧光强度均明显增强(P＜0.01);作用2 h后接受液的荧光强度较作用0.5 h明显增强(P＜0.01)，较作用1h荧光强度也有所增强(P＜0.05);作用4 h后荧光强度最强(与作用0.5、1、2 h比较，P＜0.05)。

3.3.3 累积通过量 据直线回归方程Y=97.798+433.394X，求得接受液内药物浓度，即可得到接受液内药物的含量，即药物的累积跨膜转运量ΔQ。

Fig 2 Picture of control group of sSAN-VD-FITC absorption study taken by LSCM

Fig 3 Nucelus dyed by DAPI control group of sSAN-VD3-FITC absorption study taken by LSCM

Fig 4 Picture of sSAN-VD3-FITC incubated with Caco-2 cells for 1h taken by LSCM

AP-BL方向的跨膜转运，与空白对照组相比，sSAN-VD3-FITC与Caco-2细胞作用不同时间(0.5、1、2、4 h)后，接受液内药物的含量明显增加(P＜0.05);作用4 h后接受液内的药物含量最多(与作用0.5、1、2 h比较，P＜0.05)。结果显示，sSAN-VD3-FITC由AP-BL方向通过Caco-2单层的跨膜转运随着孵育时间的延长而逐渐增加，呈现时间依赖性。

BL-AP方向的跨膜转运，与空白对照组相比，sSAN-VD3-FITC与Caco-2细胞作用不同时间(0.5、1、2、4 h)后，接受液内药物的含量均明显增加(P＜0.01);作用2 h后接受液的药物含量较作用0.5、1 h明显增加(P＜0.05);作用4 h后细胞内的转运量最高(与作用0.5、1、2 h比较，P＜0.05)。如 Tab 1所示。

3.3.4 表观渗透系数(The apparent permeability coefficient，Papp)［2］:

AP-BL方向跨膜转运的Papp较稳定，且随着作用时间的延长逐渐减小，BL-AP方向跨膜转运的Papp先上升后下降。提示sSAN-VD3-FITC的跨膜转运存在饱和现象，可能受载体介导。如Fig 6所示。

3.3.5 表观渗透率 PDR P(BL-AP)为药物从BL到AP的表观渗透系数，P(AP-BL)为药物从AP到BL的表观渗透系数。如Tab 2所示。

Tab 1 The time influence on the quantity of sSAN-VD3-FITC transport(±s，n=3)

Tab 1 The time influence on the quantity of sSAN-VD3-FITC transport(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 4 h group

Time AP-BL/μg BL-AP 0.5 h 0.291 ±0.077＊＊ 0.384 ±0.09＊＊1 h 0.515 ±0.175＊＊ 0.874 ±0.043＊＊2 h 0.920 ±0.345* 4.897 ±1.713*4 h 1.791 ±0.571 8.822 ±2.860

Tab 2 The PDR of sSAN-VD3-FITC transport over time

4 讨论

在跨膜转运实验中，Caco-2细胞模型的建立非常关键，其中包括Transwell转运装置的种类的选择、Caco-2细胞的接种、接种后细胞生长情况的检测、及模型制作完成后细胞单层完整性的判断等。

本实验选用的是内侧小室底部材料为聚碳酯膜的 Transwell，材料的孔径为 0.4 μm［1－2］，此装置被广泛应用于药物的跨膜转运实验研究。在细胞接种前对Transwell转运装置的处理，即成功地将鼠尾胶原蛋白涂在Transwell内侧小室底部的聚碳酯膜上，是成功建立模型的前提。鼠尾胶原蛋白Ⅰ型能够促进Caco-2细胞贴壁，无菌、适宜浓度的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的配制是制作模型过程中至关重要的环节。因鼠尾胶原蛋白Ⅰ型在室温下遇空气易凝固，配置溶液时应尽量在低温条件下进行，且动作应迅速，耗时不可过长。接种的细胞数量是关键，细胞数量太少，细胞很难汇合，且生长缓慢;细胞数量太多，容易发生拥挤、重叠等，不容易形成单层，影响药物跨膜转运实验的效果。此外，细胞接种成功后，对细胞的生长情况需要严密观测，通过倒置显微镜观察、检测细胞跨膜电阻(TEER)等方法进行检测。细胞生长21 d后，形成完整的细胞单层是保证跨膜转运实验成功的关键。检测方法有很多:①倒置显微镜观察细胞的融合情况:细胞已完全融合，细胞紧密连接在一起，细胞之间无空隙。② 电镜切片观察:细胞间的紧密连接和桥粒的形成、微绒毛形成，证明细胞单层致密，Caco-2细胞已成功转换为肠上皮细胞。③酚红透过率实验:(波长为560 nm)测定其酚红吸光度(D)，p酚红透过/%=D下层/D总×100%，D总为加入酚红的吸光度值［13］。④3H或14C甘露醇透过率实验:Papp＜1×10－6cm·s－1［14］，说明膜是完整的。⑤ 检测细胞跨膜电阻(TEER):Millicell-ERS检测细胞TEER，能够定性反映细胞的健康状况，并定量反映细胞的融合程度，对细胞几乎无损伤，是检测Caco-2细胞模型完整性最常用的指标。⑥荧光黄透过率检测:是胞旁通路的标志物，其透过率检测结果2 h累积透过率＜1%，说明细胞之间已经形成紧密连接，细胞单层的完整性良好，符合跨膜转运实验的要求［2］。

Fig 5 Picture of sSAN-VD3-FITC incubated with Caco-2 cells for 4h taken by LSCM

Fig 6 Transport of sSAN-VD3-FITC over time

实验结果显示，sSAN-VD3-FITC可以进行跨膜转运，并且AP-BL、BL-AP方向的跨膜转运量均随着孵育时间的延长而逐渐增加，呈现时间依赖性。但从表观渗透系数来看，跨膜转运呈现很强的有向性，AP-BL的转运速率减慢，而BL-AP的转运速率增大，由此推测sSAN-VD3-FITC的跨膜转运可能受Caco-2细胞单层AP端细胞膜上P-gp的影响，它将细胞内的sSAN-VD3-FITC作为底物排出细胞外，AP-BL方向的转运是受P-gp外排的负向作用，起到降低转运的作用，而BL-AP方向的转运可能是受P-gp的正向作用，起促进作用。因此AP-BL的转运速率减慢，而BL-AP的转运速率增大，而BL-AP的转运速率于2h达高峰，后呈下降趋势，说明存在饱和现象。吸收良好的药物的表观渗透系数Papp＞10－6cm·s－1;吸收为1% ～100%的药物表观渗透系数 Papp为0.1×10－6～1×10－6cm·s－1;而吸收差的药物(即吸收 ＜1%)的 Papp＜10－7cm·s－1［15］。本实验研究结果显示 Papp 在 0.1 ×10－6～1×10－6范围内，因此吸收为1% ～100%。但是这一相关关系主要适用于被动转运，对于吸收差的药物，Caco-2细胞模型只能作为体内吸收的一个定性而非定量指标。有文献报道在Caco-2细胞模型中吸收差的药物的透过速度是其在人的空肠中透过速度的3.33% ～1.25%，其可能原因是Caco-2细胞模型中紧密连接的渗透性比正常小肠上皮小，在体内扩散距离加长［15］。因此，sSAN-VD3在体内的吸收分数可能会比试验结果有所升高，这有待于体内药代动力学的进一步研究。

［1］Seo J J，Sun O C，So Y U，et al.Prediction of the permeability of drugs through study on quantitative structure-permeability relationship［J］.J Pharm Biomed Analysis，2006，41(4):469－75.

［2］辛华雯，吴笑春，李 馨，等.黄连素对P-糖蛋白底物在Caco-2和L-MDR1细胞跨膜转运的影响［J］.中国药理学通报，2007，23(6):799－803

［2］Xin H W，Wu X C，Li Q，et al.Effects of berberine on the transport of P-gP substrates across Caco-2 and L-MDRl cell monolayers［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(6):799－803.

［3］Tsukura Y，Mori M，Hirotani Y，et al.Effects of Capsaicin on Cellular Damage and Monolayer Permeability in Human Intestinal Caco-2 Cells［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(10):1982－6.

［4］Lim C J，Norouziyan F ，Shen W C，et al.Accumulation of transferrin in Caco-2 cells:A possible mechanism of intestinal transfer-rin absorption［J］.J Controlled Release，2008，122(3):393－8.

［5］谢海棠，王广基，赵小辰，孙建国.Caco-2细胞对人参皂苷Rg3的摄取及代谢研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9(3):257.

［5］Xie H T，Wang G J，Zhao X C，Sun J G.Study on uptake and metablism of ginsenoside Rg3［J］.Chin J Chin Pharmacol Ther，2004，9(3):257－60.

［6］Zimnicka A M，Maryon E B，Kaplan J H，et al.Human copper transporter hCTR1 mediates basolateral uptake of copper into enterocytes［J］.Biol Chem，2007，282(36):26471－ 80.

［7］Szaka'cs G，Va'radi A，Laczka C，et al.The role of ABC transporters in drug absorption，distribution，metabolism，excretion，and toxicity(ADME-Tox)［J］.Drug Discovery Today，2008，13(9):379－92.

［8］Gopalakrishnan S，Pandey N，Tamiz A P，et al.Mechanism of action of ZOT-derived peptide AT-1002，a tight junction regulator and absorption enhancer［J］.Intern J Pharma，2009，365(1-2):121－30.

［9］齐 云，王 敏，蔡润兰，等.两种方法测定灯盏花素经Caco-2细胞模型的转运［J］.中国药理学通报，2009，25(6):831－3.

［9］Qi Y，Wang M，Cai R L，et al.Transport research of breviscapine across Caco-2 monolaryer model using two assay methods［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(6):831－3.

［10］Maestrelli F，Zerroukb N，Cirri M，et al.Microspheres for colonic delivery of ketoprofen-hydroxypropyl-β-cyclodextrin complex［J］.Eur J Pharma Sci，2008，34(1):1－11.

［11］Calabro A R，Konsoula R，Frank A，et al.Evaluation ofin vitrocytotoxicity and paracellular permeability of intact monolayers with mouse embryonic stem cells［J］.Toxicol Vitro，2008，22(5):1273－84.

［12］廖日房.小檗碱联合紫杉醇经Caco-2细胞转运机制和药代动力学研究［D］广东:中山大学，2006.

［12］Liao R F.The pharmacologic study of oral paclitaxel plus berberine in rats and transport mechanism of paclitaxel across caco-2 monolayer model［D］.Guangdong:Sun Yat-sen University，2006.

［13］李秋霞，李茹柳，陈蔚文.培养时间对Caco-2单细胞层完整性及细胞连接的影响［J］.广州中医药大学学报，2007，24(1):72－5.

［13］Li Q X，Li R L，Chen W W.Influence of cultrue time on Caco-2 monolayer integrity and cell junction［J］.Guangzhou Univ Tradit Chin Med，2007，24(1):72－5.

［14］沙先谊，方晓玲 ，吴云娟.9-硝基喜树碱在Caco-2细胞模型中的体外摄取、转运及外排动力学［J］.药学学报，2004，39(10):839－43.

［14］Sha X Y，Fang X L，Wu Y J.Thein vitrokinetics of uptake，transport and effiux of 9-nitrocamptothecin in Caco-2 cell model［J］.Acta Pharma Sin，2004，39(10):839－43.

［15］杨海涛，王广基.Caco-2单层细胞模型及其在药学中的应用［J］.药学学报，2000，35(10):797－800.

［15］Yang H T，Wang G J.Caco-2 cell monolayers model and its application in pharmacy［J］.Acla Pharma Sin，2000，35(10):797－800.