组织相容性Ⅰ类相关链A位点基因多态性在预判肾移植物排斥中的意义

袁晓妮 何军 侯建全 温端改 鲍晓晶 邱桥成 王乾 钟键 李强

近年来在无人类白细胞抗原( human leukocyte antigen,HLA )错配的肾移植术后发生排斥反应的患者血清中检测到主要组织相容性Ⅰ类相关链A位点(MHC class I chain related antigens A,MICA)抗体[1-2]，并且在一些等待肾移植的终末期肾病患者血清中也检测到抗 MICA 抗体[3]。移植术后受者 MICA 基因多态性的频率增加和抗 MICA 抗体水平均与移植排斥相关。因而，对 MICA 分子的研究受到中外学者的广泛关注。由于MICA 分子表达于内皮细胞和成纤维细胞，而不表达在外周血淋巴细胞，并且 MICA分子作为配体与NK细胞的激活性受体 NKG2D结合在先天免疫中发挥重要作用[4]。因此，MICA分子在肾移植中无 HLA 抗体而发生急性和慢性排斥反应发病机制中起关键作用[2,4]。本研究在延续前期研究的基础上，着重探讨利用 MICA 基因多态性预判肾移植术前预存和移植术后新生抗MICA 抗体在排斥反应发生中的意义，现报道如下。

材料与方法

一、对象

动态分析2006年12月至2009年3月在我院接受检查的尸体或亲缘活体供肾的肾移植患者共40例，其中尸体供肾为35例，亲缘活体供肾5例。男性29例，女性11例。每例受者均在移植术前和移植术后1个月、3个月、6个月、1年和2年以上的随访时间点收取样本，所有标本收集后放至-80℃冰箱保存，随访截止时间为2009年3月。另取10名正常志愿者为对照组。

二、MICA 基因分型

采用序列特异性寡核苷酸探针( PCR-SSOP )基因分型方法( 美国One Lambda公司)，扩增条件为： 96℃变性2min，以96℃ 10 s、63℃ 60 s为1个循环，扩增10个循环，再以96℃ 10 s、59℃ 50 s、72℃ 30 s为1个循环，扩增20个循环。MICA基因型分为：MICA*001，002/020，004，005，006，007/026，008，009/049，010，011，012，013，014，015，016/019，017，018，021，022，023，024，025，027，028，029，030，031，032，033，034，035，036，037/039，038，040～053。

三、抗 MICA 特异性抗体的分析

采用免疫磁珠液相芯片技术进行抗 MICA 抗体的筛选和特异性抗体检测( One Lambda公司)。血清样本检测对应的 MICA 等位基因是MICA*001，MICA*002，MICA*004，MICA*007，MICA*009，MICA*012，MICA*017，MICA*018，MICA*019，MICA*027，MICA*027 和MICA*008 有相同的氨基酸序列。每一种 MICA 等位基因包被珠子的荧光信号用 Luminex 200 流式细胞仪检测和HLA-Fusion 软件分析。每次实验均有阴性和正常血清，当珠子的荧光信号超过 cut-off 阈值时判断为抗 MICA 抗体阳性。抗 MICA 特异性抗体阳性分值的判断标准： 1分阴性；2分为可疑阳性；4分为弱阳性；6分为阳性；8分为强阳性。

四、MICA 基因具有相同抗原表位的特征性分组

把 MICA 基因多态性具有共同的抗原决定簇归入为一组，分为MICA-G1组和MICA-G2组。MICA-G1组包括 MICA*001、 MICA*012、MICA*018、MICA*007、MICA*002和MICA*017；MICA-G2组包括 MICA*004、MICA*006、MICA*009、MICA*008和MICA*019。MICA-G1组相对应的抗 MICA 抗原为：MICA-1、MICA-12、MICA-18、MICA-7、MICA-2和MICA-17；MICA-G2组相对应的抗MICA抗原为： MICA-4、MICA-6、MICA-9、MICA-8和MICA-19。

五、HLA 抗体的筛选

所有的受者均采用LAB Screen®kit (One Lambda公司) 筛选和鉴定。HLA-Ⅰ特异性抗体检测包括HLA-A、HLA-B和HLA-Cw；HLA-Ⅱ特异性抗体检测包括HLA-DRB1、HLADQB1和HLA-DPB1，特异性抗体百分率≥10﹪为阳性。

六、血清肌酐(serum creatinine,SCr)检测采用酶法检测水平，正常值为44.2～104.0 μmol/L。

结 果

一、移植术前预存抗 MICA 抗体的分析

在 40例受者中移植术前预存抗 MICA 抗体阳性 12例，占30.0﹪(12/40)，其中 MICA 抗体10例，抗 HLA-Ⅰ类抗体和MICA 抗体均阳性 2例，抗 HLA 抗体阳性3例。33例受者均在移植术后1个月、3个月、6个月、1年和2 年接受动态随访，失访2例，肺部感染死亡1例，肾失活切除 2例，2例移植术前预存 HLA 抗体均失功。

二、MICA 基因频率的特征性分组

12例移植术前预存抗MICA抗体阳性受者分为MICA-G1组4例，MICA-G2组6例，共为MICA-G1和G2组2例。在MICA-G1组的基因频率分布从高到低为： MICA*002、MICA*001、MICA*018、MICA*007、MICA*017。在 MICA-G2组的基因频率分布从高到低为：MICA*004、MICA*008、MICA*019、MICA*009(表1)。移植术前预存抗MICA抗体中均未见MICA*012 和MICA*006。

三、移植术前供受者 MICA 基因分型和基因频率分布

在接受动态随访的 33例受者中有 16 对供受者均进行了 MICA 和HLA 基因分型。在 5 对亲缘肾移植中的供受者 MICA 和HLA 基因分型为 2 对全相合和3 对半相合；在11对尸体肾移植中的供受者MICA和HLA基因分型为3对半相合，8对均为不相合(表2)。16对供受者MICA 等位基因频率分布为 ： M*010(0.27)、M*008(0.14)、M*002(0.125)、M*009(0.11)、M*016/019、M*007(0.078)、M*004、M*027、M*033(0.05)和M*017(0.03)。在 MICA-G1组中频率M*002最高，M*007次之，M*017最低，M*012和M*018未见。MICA-G2组中频率M*008最高，M*009和M*019次之，M*004最低，M*006未见。

四、动态随访中 MICA 抗体的特异性和新生抗体的分析

33例受者在移植术后1个月、3个月、6个月、1年和2 年时间点上接受动态随访中有 7例产生了新生抗体，新生抗体率为21.2﹪。10例移植术前预存抗MICA抗体中3例移植术后新生抗MICA抗体分别为抗供者的特异性抗体( donor-specific antibody,DSA )和非供者特异性抗体( non-donor-specific antibody,NDSA )，新生抗体的时间为3个月和1年不等；1例在移植术后6个月新生抗 HLA-Ⅰ类抗体和移植术后2年新生抗HLA-Ⅱ类抗体；2例移植术前预存抗 HLA-Ⅰ类和MICA 抗体移植术后3个月新生抗HLA-Ⅰ类抗体；1例移植术前抗体阴性移植术后1个月新生MICA的DSA和NDSA抗体(表2)。另外6例移植术前预存抗 MICA 抗体的受者，动态随访期间检测抗 MICA 抗体的特异性类型均无改变，抗体的阳性分值呈现高低的波动性，并且1～2年后抗 MICA 抗体阳性均升高达到甚至超过移植术前的水平(图1～3)。

表1 移植术前受者预存 MICA 抗体的特征性分组

图1 动态随访2年中MICA-G1组患者的抗MICA抗体的变化

图2 动态随访2年中MICA-G2组患者的抗MICA抗体的变化

图3 动态随访3个月中同时具有MICA-G1和MICA-G2组患者的抗MICA抗体的变化

1例移植术前抗体阴性的受者在移植术后7 d出现排斥反应，从术前、术后7 d和术后15 d检测抗 MICA 抗体均为阴性，至术后1个月出现抗MICA 抗体阳性，特异性抗体为MICA-1、MICA-12、MICA-18、MICA-7、MICA-2、MICA-17、MICA-8和MICA-19；术后 2个月特异性抗体为MICA-18、MICA-7、MICA-2、MICA-17、MICA-8 和MICA-19，抗体的阳性分值逐渐下降。

五、抗 MICA 抗体与排斥反应和移植肾功能的相关性分析

在动态随访中 4例移植术后发生排斥反应，5号受者移植术前Scr 1079 μmol/L，移植术后7 d尿量减少为1267ml，Scr 647 μmol/L下降缓慢，且患者腹胀明显，用强的松、骁悉和雷帕鸣三联免疫治疗后尿量为 3305ml，Scr 456 μmol/L；移植术后 2 个月 Scr 92 μmol/L，改为强的松、骁悉和FK506 三联免疫治疗；移植术后1年新生 DSA 和NDSA 的 MICA 抗体。13 号受者肾移植术后 1 个月余无明显诱因的情况下突然出现发热，最高达 39℃并有乏力，日尿量 2300ml，Scr 207 μmol/L，尿素氮（blood urea nitrogen,BUN） 11.7mmol/L，术后维持MMF+Pred+新赛斯平，改为 FK506，以后每1个月左右发热 1次伴白细胞升高，移植术后1年新生 DSA 和NDSA 的抗 MICA 抗体。16 号受者移植术后 1.5 个月，无明显诱因的情况下出现发热，最高 40℃度，略感尿量减少，Scr 171 μmol/L，BUN 21.8mmol/L，给以 MMF和FK506 等免疫抑制剂治疗后症状好转；移植术后 3 个月新生 NDSA 的 HLA 抗体。32 号受者移植术前抗体阴性，Scr 675 μmol/L，移植术后 5 d Scr 下降至 133 μmol/L，用强的松、骁悉和FK506 三联免疫治疗，移植术后 10d Scr升高到 222 μmol/L，临床诊断排异；移植术后 21d Scr 206 μmol/L并出现腹泻，改用强的松、MIZ和FK506 三联免疫治疗；移植术后 1 个月出现急性排斥反应，Scr 升高到 425 μmol/L 并且检测到 MICA 抗体阳性。4例发生排斥反应受者的MICA 等位基因、抗体类型与排斥反应的临床表现（表3）。

表3 MICA 等位基因、抗体类型与排斥反应的临床表现

讨 论

本实验结果表明肾移植术前受者预存抗 MICA 抗体为30﹪(12/40)，这与国外的研究报道预存抗MICA抗体为11.4﹪[2]和18.6﹪～24.7﹪较一致[5]，移植术前预存抗MICA抗体而引起急性排斥反应的比例为25.0﹪(3/12)。肾移植术前受者预存抗MICA抗体可引起急性排斥反应，移植术后1年的存活率明显低于抗MICA抗体阴性者，抗MICA抗体与移植术后存活率的降低更密切相关[2-3]。本课题组对肾移植术前预存抗MICA抗体的受者都进行了抗供者的特异性抗体鉴定，对供受者进行了MICA基因分型，移植术前已明确供者无针对受者的特异性MICA抗原。虽然受者预存抗MICA抗体，临床判定为高危险级别移植，但移植术后即使发生急性排斥反应都经过临床及时治疗后得到了很好的控制，随访中受者移植肾功能良好，但仍需进一步随访研究。国外有研究认为，抗MICA抗体与不可逆肾移植排斥反应相关[6]，抗MICA抗体不仅与急性排异存在明显相关性[1,5]，而且抗MICA抗体的持续存在也与慢性移植肾失功有关[7]。因此，抗MICA抗体与同种异体肾移植物排斥反应有关应引起我们的高度重视。

肾移植术后新生抗MICA和HLA抗体可以是DSA和NDSA[8-9]，而本实验组中新生的抗MICA和抗HLA抗体也存在DSA和NDSA类型，并且有1例移植术前抗体阴性移植术后1个月新生抗MICA抗体，这在国内外研究中均未见报道。迄今国外也很少有MICA基因分型对研究MICA基因错配产生的抗体是直接针对供者还是针对自己的错配的研究报道[7]，我们认为供受者的MICA基因错配是产生新生抗体的主要原因，并且错配的MICA基因处于具有相同抗原表位的特征性分组中就会引起交叉免疫反应诱导了抗体的产生。MICA-G1组中的MICA-1-12-18-7-2-17分子在α1、α2和α3结构域中分别只存在36、173、206、210和215位氨基酸序列不同；MICA-G2组中的MICA-4-6-9-8-19分子在α1、α2和α3结构域中分别只存在206、210和215位氨基酸序列中不同[10]，而容易产生交叉抗体。但本组资料中还显示移植术前预存抗体的受者可新生抗MICA或HLA抗体，我们认为产生抗体的机制是MICA和HLA分子同处于6号染色体的2区1号带，并且与HLA-B、C位点最靠近。因此，新生的抗体类型是否会变得更复杂还有待于进一步观察，对于本组研究中部分病例我们将进一步采用MICA基因DNA测序的方法明确移植术后新生抗体的类型。

目前的研究已明确 MICA 有61个等位基因，10 种抗体类型，根据 MICA 的基因多态性把具有共同的抗原决定簇归入为一组对研究抗 MICA 抗体非常重要[10]。本组资料显示无论是受者预存抗体还是基因分型中的基因频率显示：在 MICA-G1组中M*002和M*001频率最高；MICA-G2组中M*008和M*004频率最高，但 M*012和M*006均未见这种基因型，这与国外报道在心脏移植中的抗体频率类同[11]。我们的研究还提示：部分移植术前预存抗MICA抗体经随访后并未增加抗体类型，1～2年后抗MICA 抗体阳性分值均升高到甚至超过移植术前的水平，我们认为可能的原因为：MICA基因α1和α2可形成抗原结合槽样结构，但其仅能容纳小于3～4个氨基酸残基，这提示MICA不能随意结合抗原肽[12]。因此，研究中国人群的 MICA 基因频率分布特点对清除或特异性吸附受者预存抗MICA 抗体有重要的应用价值，特别是对一些抗体高滴度的致敏性受者可降低移植的风险，提高移植术后带肾存活率具有非常重要的意义。

无论是 MICA 基因频率分布特点，还是MICA 特异性抗体类型与排斥反应的关系，本研究均显示M*002、M*004、M*008、M*019和M*001基因型最常见，这与国外报道M*019、M*001和M*008 相一致[7]。目前常规使用的免疫抑制剂可降低抗 MICA 抗体的表达，但是无法清除抗MICA 抗体[13]。如能特异性免疫吸附 MICA 抗体，这将是本课题组今后的研究方向。因此，移植术前分析供受者的 MICA 基因分型并进行特征性分组和受者抗 MICA 抗体的特异性鉴定；移植术后动态监测抗 MICA 抗体的变化，特别是对无HLA 抗体的受者，尤其是亲缘间的活体肾移植，是移植术后预防急性和慢性移植物排斥的重要靶分子。

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