韦氏环原发弥漫性大B细胞淋巴瘤分子分型的研究

杨 华,候 文,冉丰丰,曾丽莉,韩旭英

(遵义医学院附属医院病理科，贵州遵义563003)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常见的一种类型，原发头颈部的非霍奇金淋巴瘤绝大部分起源于韦氏环，韦氏环的解剖部位包括扁桃体、舌根、口咽、鼻咽和腭部。研究表明，DLBCL是一组在临床、组织学、免疫表型和分子遗传学等方面均存在异质性的肿瘤。近年有学者发现，免疫组化标记MUM1、CD10和bcl-6可以将结内弥漫性大B细胞淋巴瘤分为两型：活化B细胞样型（non-GCB）和生发中心B细胞样型（GCB）。目前有文献对乳腺、睾丸及胃肠道原发弥漫性大B细胞淋巴瘤的分型进行了研究，但尚未见单纯对韦氏环原发弥漫性大B细胞淋巴瘤分型的报道。本文采用免疫组化方法，探讨CD10、bcl-2、bcl-6及MUM1表达在韦氏环原发DLBCL GCB与non-GCB分型中的意义，为临床诊断、治疗和预后判断提供更客观的依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选 择遵义医学院附属医院2009~2011年间活体组织检查的弥漫性大B细胞淋巴瘤16例，全部病例均原发于韦氏环。

1.2 方法 所 有标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4m切片，常规HE染色。采用免疫组化EnVision法，所用MUM1、CD10、bc1-6、bcl-2和Ki-67的单克隆抗体和EnVision试剂盒均购自成都基因公司。以已知诊断的淋巴结原发弥漫性大B细胞淋巴瘤为阳性对照。

1.3 结果判定 免疫组化染色MUM1、CD10、bc1-6以肿瘤细胞表达阳性率>30%为(+)；bc1-2以肿瘤细胞表达阳性率>50%为(+)；Ki-67的表达采用半定量法,计数10个高倍视野中平均阳性细胞数的百分率。bcl-2阳性定位于胞质内，CD10定位于细胞膜，bcl-6、MUM 1和Ki-67定位于细胞核。

1.4 统计学分析采用SPSS15.0统计软件进行独立样本 检 验。

2 结果

2.1 临床资料 16例韦氏环原发DLBCL中男性10例，女性6例，发病年龄35~74岁，平均52.5岁。病变部位：扁桃体10例（其中左侧6例,右侧3例,双侧1例），占62.5%；口咽2例；鼻咽3例；腭部1例。16例淋巴瘤的形态学均满足弥漫性大 B细胞淋巴瘤的诊断标准，即肿瘤细胞弥漫性分布，细胞核大于正常淋巴细胞核的2倍(图1)，肿瘤细胞LCA、CD20和CD79a弥漫阳性。

2.2 免疫组化 依照Hans[1]分类，16例韦氏环原发DLBCL中，GCB型5例(31.2%)，其中2例CD10(-)、MUM1(-)、bcl-6(+)；2 例同时 CD10、bcl-6 和MUM1(+)；1例CD10和bcl-6(+),MUM1(-)。非GCB型11例(68.8%)，其中10例CD10(-),bcl-6和MUM1(+)；1 例CD10 和bcl-6(-)，MUM1(+)(图2、3、4)。

2.3 分型与增殖活性及细胞凋亡的关系 11例非GCB型的增殖指数为50%~80%，平均68.2%(图5)；其中6 例(54.5%)bcl-2(+)(图 6)。5例 GCB 型的增殖指数为30%~90%，平均55.0%；其中1例(20.0%)bcl-2(+)。非GCB型与GCB型增殖指数统计学差异无显著性（P=0.368）。非GCB型与GCB型bcl-2阳性率统计学差异无显著性（=0.197）。

图1 DLBCL肿瘤细胞体积大，弥漫分布，细胞核是正常淋巴细胞核的2倍×400 HE图2 GCB型肿瘤细胞膜CD10阳性×400 En Vision法图3肿瘤细胞核bcl-6阳性×400 En Vision法图4肿瘤细胞核MUM1阳性×400 En Vision法图5肿瘤显示高的Ki-67增殖活性×400 En Vision法图6肿瘤细胞浆bcl-2阳性×400 En Vision法

3 讨论

原发头颈部的非霍奇金淋巴瘤绝大部分起源于韦氏环，原发扁桃体的NHL约占韦氏环淋巴瘤发病率的70%[2]，而弥漫性大B细胞淋巴瘤大约占65%。本组资料显示，韦氏环原发的弥漫性大B细胞淋巴瘤发病年龄以中老年多见，男性略多于女性，平均发病年龄53.3岁。发病部位绝大多数发生在扁桃体（62.5%），与上述报道接近。

DLBCL是一种具有明显分子异质性的疾病，依照基因表达谱的特征，Alizadeh等[3]将DLBCL分为两种类型：①具有正常生发中心B细胞基因表达特征的生发中心细胞型(germinal center B-cell like,GCB)，表达CD10、bcl-6、Lmo-2、A-myB、JAW1等，致病机制涉及bcl-2癌基因(t14；18)染色体的移位；②具有活化B细胞基因表达模式的活化细胞型(activated B-cell-like，ABC)或非生发中心型(non-germinal center B-cell like，non-GCB),表达MUM1/(IRF-4)、FOXP1、cyclinD2、Flip 等，发病机制涉及NF-B的活化。两种类型具有不同的预后，其中5年生存率GCB型为60%，高于ABC型的35%。其后Rosenwald等[4]又鉴定出第3个亚型，其预后与GCB相似，归入GCB型。由于两型DLBCL具有不同的预后，因此正确分型对于患者的治疗和预后具有重要意义。国外最初对于DLBCL的分型研究是采用cDNA微阵列技术在基因水平上的研究[4，5]。c DNA微阵列技术要求新鲜或冰冻标本以提取足够的RNA，所使用芯片的价格比较昂贵，临床上难以推广应用。近年来人们把研究的方向转向蛋白的表达上，Hans[1]等发现利用一些蛋白表达的差异同样也可将DLBCL分为GCB与non-GCB，这些蛋白包括 CD10、bcl-6、MUM1。

CD10是急性淋巴母细胞性白血病的共同抗原，为膜相关的中性肽链内切酶，在淋巴细胞的分化过程中，它表达于前B细胞和生发中心B细胞，大约75%的前B淋巴母细胞性白血病及大部分滤泡性淋巴瘤均表达CD10，可以作为GCB的标记物。bcl-6是一种具有转化抑制功能的锌指蛋白，它参与调节淋巴细胞分化、免疫反应、细胞周期发育调控等重要的功能。在正常淋巴滤泡生发中心的形成和淋巴细胞的分化中起重要作用，主要表达于生发中心细胞，是生发中心细胞的另一个标记物[6]。MUM1/IRF4是一种骨髓瘤相关的癌基因，有研究表明MUM1缺陷鼠不能形成生发中心细胞，同时血清免疫球蛋白水平大幅度下降，活化的淋巴细胞和浆细胞数量明显减少，提示MUM 1在B细胞分化的终末阶段起重要作用，可作为后生发中心来源细胞的标记物[7]。Hans等以c DNA微阵列为参照标准，应用免疫组化标记CD10、bcl-6和MUM 1 3种抗体对DLBCL进行分型。首先标记CD10和bcl-6，CD10阳性或CD10和bcl-6同时阳性者为GCB型；CD10和bcl-6均阴性为非GCB型；若CD10阴性，而bcl-6阳性，则再用MUM 1标记，MUM1阳性为非GCB型，MUM1阴性为GCB型。另有研究[8，9]发现bcl-2对预测临床预后也具有十分重要的意义,bcl-2是一种抗凋亡蛋白,其在淋巴瘤中的过度表达可能预示肿瘤具有高的侵袭力和较差的预后，在对DLBCL亚型分类亦显得特别重要。

本组研究结果显示，16例韦氏环原发DLBCL中，GCB型5例(31.2%),非GCB型11例(68.8%)。11例非GCB型的平均增殖指数与5例GCB型的平均增殖指数分别为68.2%、55.0%，两者之间比较差异无显著性。本研究中bcl-2的阳性表达率非GCB型为54.5%，GCB型为20.0%，两者之间差异无显著性，但非GCB型中bcl-2的阳性表达率显著高于GCB型，说明非GCB型可能具有更高的侵袭性和差的预后。两者之间差异无显著性可能与本组资料收集的样本量少有关，有待加大样本量统计分析得出更有说服力的统计数据。Al-Abbadi[10]对睾丸原发性DLBCL的分析、Yoshida等[11]对15例乳腺原发性DLBCL的研究及张丽华等[12]对胃肠道原发性DLBCL的分型研究均显示，结外发生的弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子分型均以非GCB型多见，预后差。本研究也显示韦氏环发生的弥漫性大B细胞淋巴瘤也是以非GCB型为主，和以上研究结果相同，提示结外发生的DCBCL可能均以非GCB多见,预后均较结内发生的DCBCL差。

[1]Hans CP,Weisenburger DD,Greiner TC,etal.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunoh istochemistry u sing a tissue micro array[J].Bloo d,2004,1 03(1):275-2 82.

[2] Shima N,Kobashi Y,Tsutsui K,et al.Extranodal non-Hodgkin's lymphoma of the head and neck[J].Cancer,1990,66(6):1190-1197.

[3] Alizadeh AA,Eisen MB,Davis RE,et al.Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling[J].Nature,2000,403(6769):503-511.

[4] Rosenwald A,Wright G,Leroy K,et al.Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin's lymphoma[J].J Exp Med,2003,198(6):851-862.

[5]Wright G,Tan B,Rosenwald A,et al.A gene expressionbased method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(17):9991.

[6] 陈愉,宋兰英,蒋会勇,等.弥漫性大B细胞淋巴瘤CD10,bcl-6,MUM1蛋白表达与分子分型[J].中华血液学杂志,2005,26(10):623-624.

[7] Tsuboi K,Iida S,Inagaki H,et al.MUM1/IRF4 expression as a frequent event in mature lymphoid malignancies[J].Leukemia,2000,14(3):449-456.

[8] Muris JJ,Meijer C,Vos W,et al.Immunohistochemical profiling based on Bcl-2,CD10 and MUM1 expression improves risk stratification in patients with primary nodal diffuse large B cell lymphoma[J].J Pathol,2006,208(5):714.

[9]Colomo L,Lopez-guillermo A.Clinical impact of the differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Blood,2003,101(1):78.

[10]Al-Abbadi MA,Hattab EM,Tarawneh MS,et al.Primary testicular diffuse large B-cell lymphoma belongs to the nongerminal center B-cell-like subgroup:a study of 18 cases[J].Mod Pathol,2006,19(12):1521-1527.

[11]Yoshida S,Nakamura N,Sasaki Y,et al.Primary breast diffuse large B-cell lymphoma shows a non-germinal center B-cell phenotype[J].Mod Pathol,2005,18(3):398-405.

[12]张丽华,周强,郭京,等.胃肠道原发性弥漫性大B细胞淋巴瘤的分型研究 [J].诊断病理学杂志,2008,15(6):479-481.