金钗石斛生物总碱对小鼠肝组织细胞色素P450的影响

陆远富，朱梦如，2，吴芹，徐亚沙，刘杰*

(1.遵义医学院 药理教研室暨贵州省基础药理重点实验室，2.药学院，贵州遵义563003)

金钗石斛入药始载于《神农本草经》，被列为上 品。《本草纲目》中记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，状筋骨，暖水脏，补肾益力，强身延年[1]。其主要以新鲜或干燥的茎入药，性微寒，味甘；有生津益胃、清热养阴等功效；用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明、萎缩性胃炎、浅表性胃炎、慢性结肠炎等，是石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散、脉络宁等制剂的重要配伍[2]。金钗石斛的药用成分主要是石斛碱及多糖类物质，传统认为，中药石斛的有效成分即为生物碱，并常以之作为评价石斛质量的重要指标。生物碱为金钗石斛次生代谢产物，它是中药材中众多有效化学成分种类之一，其药理作用广泛。

肝脏微粒体的细胞色素 P-450酶系统（cytochromeP450或CYP450,简称CYP450）是一个结构和功能相关的基因超家族的超家族酶系[3]，为人体内代谢药物的主要酶，是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢。大多数药物都是经CYP450酶代谢的，如果某个药物对CYP450有诱导或抑制作用，当他与其他药物联合使用时，有可能改变其他药物在体内的血药浓度水平，从而影响其生物活性或毒性。所以对肝药酶有影响的药物，也会影响到药物的代谢。肝药酶具有个体差异大、易受药物的诱导和抑制的特点。由于遗传因素或环境因素都可造成不同个体P450基因变异,从而引起P450酶活性差异,使体内由它催化的许多代谢和效应存在着明显的差异,因此P450基因多态性是造成不同个体药物代谢差异的基础[4]。药物的生物转化是由多种药酶催化进行的,而药酶遗传多态性是引起临床药动学特征变异、药物不良反应和治疗失败的主要原因[5，6]。最新研究表明细胞色素P450还是药物代谢过程中的关键酶，而且对细胞因子和体温调节都有重要影响。

在人体，有功能意义的 CYP450同工酶约50种，其中CYP3A、CYP2C、CYP2D和CYP2E亚族几乎代谢了 90%的药物。金钗石斛生物总碱对CYP450同工酶的影响，在药物连用中会直接影响CYP450同工酶对其它药物的代谢。本实验旨在对金钗石斛生物总碱对肝细胞色素P450的影响，从而判断它与其他药物联合使用时，有可能对其他药物在体内的血药浓度水平的改变，从而影响其生物活性或毒性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明种小鼠，雄性，体重20~25g，第三军医大学提供，许可证号SCXK-2002003。

1.1.2 仪器 超声仪（上海冠特超声仪器有限公司）；3K3型高速冷冻离心机（德国Sigma）；TU1810紫外分光光度仪（北京谱析仪器厂）；电子天平（北京赛多利斯电子有限公司产品）；RNA逆转录仪（德国Eppendorf公司）；实时定量RT-PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）；XW-80A漩涡混合仪（海门市其林贝雨仪器制造有限公司）；GZX-9246 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.1.3 试剂 金 钗石斛生物总碱由遵义医学院基础药理贵州省重点实验室提取；三氯甲烷，由成都市科龙化工试剂厂提供（批号：20080313）；异丙醇，由成都市科龙化工试剂厂提供（批号：20100225）；无水乙醇，由重广川东化工（集团）有限公司化学试剂厂提供（批号：20060628）；Power SYBR Green PCR（Applied Biosystems）；High-Capacity CDNA Reverse Transcription Kits（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组昆明种雄性小鼠15只，体重20~25g，随机均匀分为空白组、金钗石斛生物总碱低剂量组、金钗石斛生物总碱高剂量组各5只。随机分组后灌胃6d：①空白组，灌胃蒸馏水0.4mL/只；②金钗石斛生物总碱低剂量组（20 mg/kg）；③金钗石斛生物总碱高剂量组（60 mg/kg）。

1.2.2 取材 用 10%的水合氯醛（0.035mL/10g）麻醉小鼠，眼眶取血1.0mL静置。固定小鼠，剪开腹腔取肝脏。相应部位肝脏甲醛固定HE染色观察。血液离心取上清液测ALT、AST。

1.2.3 RNA的提取取肝脏于TRIzol液中充分匀浆，加入氯仿，快速摇匀，离心取上清液；上清液+等体积异丙醇，离心弃去上清液；加入75%的酒精清洗沉淀离心,小心弃去酒精，在滤纸上倒置数分钟，DEPC水溶解。

1.2.4 RNA的纯化 在 粗提RNA的EP管内加入RP350L+75%酒精250L，将以上混合体转移到RNA纯化柱，离心；75%酒精加入柱内进行离心，重复一次。将管内的洗脱液倒掉后再空转一次，把纯化柱移入新的EP管内，加入DEPC水进行洗脱，EP管内的100L水溶液即纯化的RNA液待测样品。

1.2.6 实时定量RT-PCR扩增 按 试剂盒说明方法，提取总RNA，逆转录合成第1链互补脱氧核糖核酸(c DNA)，然后通过特异性引物PCR扩增小鼠肝组织中的CYP1A1、CYP1A2、CYP3A11、CYP3A25、CYP4A10、CYP4A14、CYP7A1、CYP1B1、CYP2B10、CYP2E1和内部参照物基因。

表1 实验所用基因上下游引物序列 (5'-3')

2 结果

2.1 金钗石斛生物总碱对小鼠肝组织的病理的影响高剂量组与空白组的病理切片在高倍镜下的比较，小鼠肝细胞在用药后无明显变化，肝脏细胞组织间也无明显变化（见图1）。

图1 金钗石斛生物总碱对小鼠肝组织的病理的影响（n=5）

2.2 金钗石斛生物总碱对小鼠肝功能的影响 送检血样测定AST和ALT，金钗石斛生物总碱高、低剂量组对小鼠血清ALT和AST均无影响（见表2）

表2 金钗石斛生物总碱对小鼠肝功能的影响（n=5， ±em）

2.3 金钗石斛生物总碱对小鼠肝组织CYP450同工酶的影响 在本实验中测定了金钗石斛生物总碱对部分CYP450同工酶的影响，本实验结果显示金钗石斛生物总碱对CYP4A10、CYP4A14、CYP2B10、CYP7A1有显著性影响（＜0.05）：其中金钗石斛生物总碱低剂量对CYP4A10有明显的抑制作用（＜0.05），金钗石斛生物总碱高剂量对CYP4A10有上调作用；金钗石斛生物总碱低剂量对CYP4A14有上调作用，其高剂量对CYP4A14的上调作用更明显（＜ 0.05）；金钗石斛生物总碱低剂量对CYP2B10有抑制作用，高剂量对CYP2B10有明显的上调作用（＜0.05）；金钗石斛生物总碱高、低剂量对CYP7A1有明显的抑制作用（＜ 0 .05），其他相关数据显示金钗石斛生物总碱对 CYP1A1、CYP1A2、CYP3A25、CYP1B1、CYP2E1、CYP3A11基因无显著性影响（＞0.05）。（见表 3 ）

表3 金钗石斛生物总碱对CYP450同工酶的影响（n=5， ±em）

3 讨论

药物代谢性相互作用是指两种或两种以上药物在同时或前后用药时，在代谢环节发生相互作用，结果使疗效增强甚至产生不良反应，或疗效减弱甚至失败。由于代谢是大多数药物药动学的重要环节，因此，药物代谢性相互作用具有重要的临床意义。药物代谢性相互作用分为酶抑制作用和酶诱导作用。选取金钗石斛生物总碱临床用量，在其对肝脏正常功能无显著性影响的前提下，研究石斛总在药物代谢中对药物代谢酶的影响。在临床联合用药时，有助于判断其他药物在体内的血药浓度水平可能的改变方向，对合用药物及其用量的选择上有指导性意义。

肝脏中参与药物代谢的最主要的就是细胞色素P450,其作用和代谢与细胞色素CYP450相关基因的含量和活性有关[8,9]。其中人类CYP 1A家族由CYP1A1及CYP1A2组成,CYP1A1主要代谢多环芳烃类致癌剂，CYP1A1酶具有较强的活化多环芳烃的能力,最终使体内致癌物的浓度升高,从而增加癌变的可能性[10]。在人类的肝脏中,CYP1A2占所有细胞色素P450氧化酶的13%,含量最高 。CYP1A2参与许多药物的氧化代谢,还参与某些多芳香烃类、杂环氨类、亚硝基胺类等前致癌物及终致癌物的代谢[11]。本实验显示金钗石斛生物总碱对小鼠 C YP1A1和 C YP1A2基因表达无显著性影响，但与相关致癌物及终致癌物的代谢是否也是无显著性影响有待进一步实验验证。

CYP3A是重要的CYP450酶系，在临床代谢和药物治疗中具有重要作用，临床中约60%的药物经CYP3A催化代谢。本实验结果显示金钗石斛生物总碱对小鼠的CYP3A11、CYP3A25基因无显著影响，提示金钗石斛生物总碱与大多数药物合用相对安全。

金钗石斛生物总碱低剂量对小鼠CYP4A10有明显的抑制作用，金钗石斛生物总碱高剂量对小鼠CYP4A10有诱导作用；金钗石斛生物总碱低剂量对小鼠CYP4A14有诱导作用，其高剂量对小鼠CYP4A14的诱导作用更明显。金钗石斛生物总碱对小鼠CYP4A14基因表达有明显的诱导，在与CYP4A14催化代谢的药物合用时，参考疗效可能要适当考虑减少CYP4A催化代谢的药物的用量，以保证用药安全。金钗石斛生物总碱对小鼠CYP7A1有抑制作用，CYP7A1基因编码胆固醇转化成胆酸过程中的限速酶胆固醇7羟化酶，胆固醇7羟化酶是由基因CYP7A1表达的。胆固醇7羟化酶是经典途径的主要限速酶，胆酸可通过多种机制来反馈抑制CYP7A1基因的表达[13]。本实验结果显示金钗石斛生物总碱对小鼠CYP7A1基因有抑制作用，提示金钗石斛生物总碱可能影响胆酸代谢，其具体作用有待进一步研究。

CYP2E1是一个重要的Ⅰ相代谢酶,主要代谢小分子量的前致癌物和前毒物,如亚硝胺类等致癌物,醋氨酚、氯唑沙腙等药物以及乙醇、丙酮等有机物[14]。近年来研究发现,亚硝胺类致癌物的代谢激活及细胞毒性作用由CYP2E1介导,化学致癌物由CYP2E1代谢激活后与DNA、RNA或蛋白质分子形成加成物而导致细胞损伤[15，16]。本实验结果显示金钗石斛生物总碱对小鼠 CYP2E1基因无显著影响，提示金钗石斛生物总碱导致细胞损伤的可能性较低。

4 结论

金钗石斛生物总碱对CYP4A10、CYP4A14、CYP2B10、CYP7A1、PPARa、FXR有显著性影响。

[1] 黄小燕，乙引.气相色谱法测定金钗石斛中石斛碱的含量[J].贵州师范大学学报(自然科学版),2007,25(4):92-94.

[2] 王康正，高文远．石斛属药用植物研究进展[J]．中草药，1997，28(10)：633-635．

[3] 冷欣夫，邱星辉.细胞色素P450酶系的结构、功能与代谢前景[M].北京：科学出版社，2001,56-69.

[4]杨明，唐波，陈经宝，等.染料木素临床不良反应与CYP1A2、UGT1A7基因多态性研究[J].临床药理学,2008,13(7):803-808.

[5] Akaza H,Miyanaga N,Takashima N,et al.Comparisons ofpercent equol producers between prostate cancer patientsand controls:case--controlled studies of isoflavones in Japanese,Korean and American residents[J].Jpn J Cin Oncol,2004,34(2):86-89.

[6] 李家泰.临床药理学[M].北京:人民卫生出版社,2001.1409-1411.

[7] 陆刚，唐晓波，鲍岩岩，等.细胞色素P450 CYP4A的组织和细胞表达特异性[J].中国药理学杂志，2007，21（6）：505-511.

[8] Rendic S,Di Carlo FJ.Human cytochrome P450 e nzymes:A status report summarizing their reactions,substrates,inducers and inhibitors[J].Drug Metab Rev,1997,29(1/2):413-580.

[9] Setchell KD,Cassidy A.Dietary isoflavones:biological effects and relevance to human health[J].Nutrition,1999,129(3):758-767.

[10]姜烈君,覃桂芳.细胞色素P4501A1、谷胱甘肽转硫酶基因多态性和慢性粒细胞白血病的相关性研究[J].广西医科大学学报,2009,26(4):544-546.

[11] 葛京平,魏武,商学军,等.前列腺癌患者CYP1A2 IVS4+43A/G基因型分析[J].中华男科学杂志,2007,13(11):1002-1004.

[12]苏娇，何淑雅，SU Jiao，等.FXR基因家族[J].国际遗传学杂志，2007,30（2）：127-129.

[13]Chiang JY.Regulation of bile acid synthesis:Pathways,nuclear receptors,and mechanisms［J］.J Hepatol,2004,40(3):539-551.

[14]侯德富,万恂恂,贺智敏,等.Tet调控CYP2E1基因表达细胞系的代谢能力分析［J］.中国生物化学与分子生物学报,2009,25(2):163-168.

[15]Nouso K,Thorgeirsson S S,Battula N.Stable expression of humancytochrome P450IIE1 in mammalian cells:metabolic activation of nitrosodimethylamine and formation of adducts with cellular DNA[J].Cancer Res,1992,52(7):1796-1800.

[16]Schmalix W A,Barrenscheen M,Landsiedel R,et al.Stable expression of human cytochrome P450 2E1 in V79 Chinese hamster cells[J].Eur J Pharmacol,1995,293(2):123-131.

[17]张西果.代谢疾病中胆酸信号系统的研究[J].国际药学研究杂志，2008，35（6）：461-463.

[18]陈建伟,马虎,黄燮南，等.金钗石斛生物总碱对脂多糖诱导大鼠学习记忆功能减退的改善作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2008，22(6):406-411.

[19]Miyake JH,Wang SH,Davis RA.Bile acid induction of cytokine expression by macrophages correlates with repression of hepatic cholesterol 7a Hydroxylase[J].J Biol Chem,2000,275(29):21805-21808.

[20]杨秀芬，钟正贤，廖梅春，等.蛇葡萄素与苯并芘合用对大鼠肺组织内CYP和GST基因表达的影响[J].中国药理学通报，2010，226(1):135-6.

[21]李墅，王春兰，郭顺星.高效液相色谱法测定金钗石斛中石斛碱含量[J].中国药学杂志,2009,44(4):252-254.

[22]朱仁全,余茂耘，李 建.石斛乙醇提取物对豚鼠降血压作用初步研究[J].滁州学院学报，2009，11（2）：62-63.