CD40和CD86在慢性阻塞性肺疾病患者中的变化及意义

符丹丹，欧阳瑶，薛令合

（遵义医学院附属医院 呼吸内科，贵州遵义563000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pul- monary Disease,COPD）是威胁中老年健康的常见疾病，其发病机制尚未完全清楚，目前认为主要与气管、支气管炎症反应有关。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是体内功能最强的抗原递呈细胞（Antigen Presenting Cells，APCs），表达多种识别外源性抗原的受体，并监控黏膜上皮表面出现的各种危险信号，快速高效地摄取、加工处理和提呈抗原，显著地刺激初始型T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。正常情况下，DCs持续性低水平表达CD40、CD86分子，但在炎症刺激的过程中CD40、CD86分子的表达会明显上调[1]。此外，DCs上MHCII类抗原也是靠CD40分子维持其高水平的表达[2]。目前，有关DCs在COPD发病中的作用知之甚少，因此，本研究将通过检测不同COPD人群痰液中DCs的表面标志物CD40和CD86分子的表达变化，探讨DCs与COPD的关系。

1 对象和方法

1.1 对象及分组 纳 入我院2008年1月至2009年3月住院患者51例，分为Ⅰ组：无吸烟正常对照组（n=5，平均65.1±4.5岁）；Ⅱ组：吸烟无COPD组（n=5，平均69.2±2.6岁）；Ⅲ组：COPD GOLDⅠ级（n=11，平均68.9±7.4岁）；Ⅳ组：COPD GOLDⅡ级（n=17，平均71.0±5.7岁）；Ⅴ组：COPD GOLDⅢ~Ⅳ级（n=13，平均72.9±6.5岁）。入院当天采集临床资料。参照《根据2007版慢性阻塞性肺疾病全球倡议（GOLD）评价》，对COPD患者按病情轻重程度进行分级，对COPD患者的病情严重程度进行临床评估。

1.2 肺通气功能测定 采 用意大利MIR肺功能仪，参照美国胸科协会肺功能检查操作规范进行常规肺通气功能测定。本研究观察指标包括：用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积（FEV1%）、FEV1/FVC。

1.3 标本采集 采 用氧气雾化吸入法收集受试者的诱导痰，采用改良pin法，常用梯度高渗盐水法，试剂配制：3%、4%、5%高渗盐水，0.1%二硫苏糖醇(DTT)等。

1.4 痰液处理及标本 测 定①痰液称重，加入2倍体积的0.1%的DTT充分混合，在漩涡振荡器上混匀；②再置于37℃恒温水浴箱中孵育并震荡30min,加入与DTT等体积的D-PBS后继续水浴并震荡5min；③将稀释的痰液经4层无菌纱布过滤，滤液在离心机中以1000r/min的速度离心10min，弃上清；④细胞层（沉淀）用D-PBS重悬，用300目尼龙网过滤，并在离心机中以1000r/min的速度离心10min，离心2次，吸管吸去每次离心后的上清液；⑤沉淀用D-PBS重悬，在倒置显微镜下调整细胞数为1×106/mL；⑥分别加入两个流式细胞仪专用试管内；⑦其中一个管作为自身对照管；向另一个管内加入Mouse Anti-Human CD40（美国BD公司），PE 5l和Mouse Anti-Human CD86（美国BD公司），FITC 5L作为待测标本管，加入试剂时均需漩涡混匀；⑧室温避光孵育30min，尼龙网过滤；（9）4℃避光流式细胞仪检测。

1.5 统计学处理 所 有数据均用SPSS11.0统计学软件包进行统计分析。计量资料数据均采用均数±标准差（±）表示。两组间的比较，采用两独立样本检验。两因素相关分析用直线相关分析＜0.05，有统计学差异＜0.01认为有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 不同受试组基本资料及肺功能比较 对 不同受试组的性别及年龄进行两两比较无明显差异（＞0.05），具有可比性。各组肺功能测定结果如表1。

表1 不同受试组肺功能的测定结果Tab 1 The results of pulmonary function in the different groups

2.2 诱导痰中的DCs CD40的测定结果：CD40在GOLDⅠ级、GOLDⅡ级及GOLDⅢ~Ⅳ级均高于正常对照组和吸烟无COPD组。且有显著统计学意义（P＜0.01），但正常无吸烟组与吸烟无COPD组无统计学意义（见表2，图1）。CD86的测定结果：CD86在GOLDⅠ级、GOLDⅡ级以及GOLDⅢ~Ⅳ级均高于正常对照组和吸烟无COPD组。且有显著统计学意义，但正常无吸烟组与吸烟无COPD组无统计学意义（＜ 0 .01）（表2，图 2 ）。

表2 不同受试组痰CD40和CD86的测定结果Tab2 The resultsof sputun CD40in the differentgroups

图1 各组DCs的CD40的表达

图2 各组DCs的CD86的表达

2.3 DCs与FEV1%的相关性分析 DCs与FEV1%呈负相关关系（r=－0.913,－0.893＜0.05）

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病是引起世界范围内致死和致残的重要疾病。COPD的发病机制尚不清楚，可能与多种因素有关，其中吸烟和感染被认为是最重要的两个因素。

DCs最早由美国学者Ralph于1973年发现，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。目前COPD与肺部DCs的关系，国内尚未见报道，国外相关研究也较少，且结果并不一致。来自大鼠COPD模型的研究显示DCs亦参与了COPD的发病机制。D'hulst等[3]研究显示，吸烟小鼠气道和肺实质炎症细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等进行性增加，支气管肺泡灌洗液（Broncho-alveolar Lavage，BAL）的分析结果显示，吸烟3d时就可见肺内DCs开始增多；80d时，气道和肺实质的DCs浸润明显增加，DCs的主要组织相容性抗原MHC II分子和共刺激分子CD40、CD86等表达上调，且出现类似于肺气肿和COPD的肺形态学改变。此外，Zeid等[4]研究亦证实被动吸烟的大鼠肺内DCs的数目明显增多。但这些结果均未涉及COPD患者。

本研究采用流式细胞仪检测DCs的表面标志CD40和CD86表达水平，分析COPD患者诱导痰中DCs数量的变化，探讨DCs与COPD的关系，国内鲜有类似报道。结果显示，所有COPD患者，无论GOLD分级水平高低，CD40和CD86表达水平均明显高于正常对照组和吸烟无COPD组（＜ 0 .01），这提示，与无吸烟的正常对照组及吸烟无COPD组相比，COPD患者气道中DCs的数量是明显增加的。同时，本研究根据FEV1%水平对COPD患者病情严重程度进行分级后，探讨DCs数目与COPD病情严重程度的关系，结果显示，COPD患者中，随着GOLD分级增加和FEV1%水平的降低，DCs的数量明显增加，与COPD病情严重程度成正相关，与Demedts等[5]的研究结果类似。由此推测，DCs数目可反映COPD患者气道病变的严重程度，亦可作为气流阻塞的一个客观指标对COPD的病情变化做出一定的评估。

吸烟是否影响肺组织中DCs的数量仍有一些争议。D'hust等[3]研究显示吸烟小鼠气道和肺实质中DCs浸润明显增加但也有不一致的结论。Demedts等[5]研究发现，COPD患者较吸烟无COPD者以及从不吸烟者气道DCs数目明显升高，但吸烟者与不吸烟者气道DCs数目没有差异，提示DCs在COPD患者中数目增加，且以小气道（直径＜2mm）中DCs数目增加为主[6]。Rogers等[7]比较了吸烟与已戒烟的COPD患者中支气管粘膜上皮DCs数目差别，结果显示：与已戒烟的COPD患者相比，吸烟的COPD患者和吸烟正常人上皮下组织中DCs数目均明显减少（分别为<0.05,<0.01），而已戒烟的COPD患者DCs数目与变应性哮喘和健康人DCs数目相似。这一研究表明，在COPD患者中，吸烟者DCs数目是降低的。Robbins等[8]的研究显示，吸烟可以减少小鼠肺部DCs数目，影响肺部抗病毒免疫功能。不仅如此，长期吸烟能降低DCs的成熟和功能，增加肺部反复感染几率和恶化频率，加速COPD进程[9,10]。本研究中所选取的COPD患者均为长期大量吸烟者（均＞400年支），分析发现，在吸烟的COPD患者诱导痰中CD40和CD86的表达显著上调，进一步说明DCs在COPD患者的气道浸润明显增加；而正常无吸烟者的DCs的数量与吸烟无COPD者DCs数量无明显差异。这似乎提示，吸烟并不影响肺部DCs的数目。但本研究标本量偏少以及吸烟且COPD者的吸烟指数较低亦可能影响结果分析。总之，吸烟是否影响COPD患者肺部DCs数目尚未完全明确，有待进一步深入研究。

综上所述，本研究在国内首次证明了COPD患者气道内DCs数量的明显增加，且与COPD病情的严重程度呈正相关。未来的研究需探讨DCs在COPD的发病机制中所扮演的角色，从而为COPD的治疗提供一个新的思路。

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