血红蛋白在Span 80/PEG 400/H2O囊泡体系中的结构性质

2011-11-30 10:50王元有刘天晴
物理化学学报 2011年8期
关键词:透射电镜荧光稳定性

王元有 华 伟 刘天晴,*

(1扬州大学化学化工学院,江苏扬州225002;2扬州工业职业技术学院,江苏扬州225127)

血红蛋白在Span 80/PEG 400/H2O囊泡体系中的结构性质

王元有1,2华 伟1刘天晴1,*

(1扬州大学化学化工学院,江苏扬州225002;2扬州工业职业技术学院,江苏扬州225127)

通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、动态光散射、圆二色谱、负染-透射电镜(NS-TEM)和冷冻蚀刻-透射电镜(FE-TEM)等实验方法研究了血红蛋白(Hb)与Span 80/PEG 400/H2O囊泡间的相互作用及其结构特性.结果表明:Hb易于吸附在囊泡表面,使得囊泡的表观半径稍有增大;Hb的肽链在囊泡表面能够逐渐伸开,特征荧光峰强度显著增强,部分氨基酸残基进一步暴露,α-螺旋结构含量减少,β-折叠和β-转角结构含量增加,无规卷曲结构含量基本不变.囊泡体系中Hb的稳定性与囊泡的稳定性有关.

血红蛋白;结构;性质;非离子囊泡

1 引言

囊泡是分子有序组合体的一种重要形式,具有类似细胞膜的双层膜结构特性,因此它不仅可以用作细胞膜模型,也作为肿瘤和病毒的靶向药物的载体,具有极其广泛的应用.1-11由非离子表面活性剂所形成的囊泡,不仅在结构和性质上与由脂质体形成的囊泡相似,而且用于制备非离子型囊泡所用的材料具有相对较低的价格,制备简单、方便,12可进行大批量生产,也可避免不适合溶剂的选择问题,因此非离子囊泡将具有更为广阔的应用前景.人们在应用囊泡研究生物膜、药物释放、基因载体等过程中,常常仅研究其性质、变化规律和效果,但囊泡对生命体系中蛋白结构性质的影响和囊泡与蛋白间的相互作用的研究报道较少,这一方面限制了人们对囊泡在生命体系中的功能和作为生物膜模拟模型的可靠性的深入理解和验证;另一方面,也限制了囊泡的功能性应用的拓展.本文在成功地制备高稳定、生物型Span 80/PEG 400/H2O非离子型囊泡基础上,13通过紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱、圆二色谱、负染-透射电镜、冷冻蚀刻-透射电镜等方法,研究Span 80/PEG 400/H2O囊泡体系中的Hb结构性质及形貌,囊泡与蛋白间的相互作用,分析PEG 400对囊泡与蛋白间相互作用的影响,为生命体系中囊泡与蛋白间的相互作用与影响以及生物膜与蛋白间的相互关系等提供可靠的实验依据和理论指导,为最终揭示生物膜与蛋白的作用机理提供了重要的范例,对生物膜的功能性研究和应用也具有较深的理论与实际意义.

2 实验部分

2.1 实验试剂

血红蛋白(Hb,BR,国药集团化学试剂有限公司),Span 80(AR,上海大众制药厂),PEG 400(AR,国药集团化学试剂有限公司).水为二次蒸馏水.

2.2 非离子囊泡的制备

将Span 80、PEG 400和水按一定质量比混合、振荡,超声10-15 min(CQX25-06超声波清洗器,上海必能信超声有限公司),制得非离子囊泡.通过影像分析(SK-882 Image Analyzer,Sanko Co.,Japan),观察囊泡的大小、分布和稳定时间.

2.3 紫外-可见吸收光谱的测定

配制一系列Span 80/PEG 400/H2O/Hb溶液,恒温30 min,测定溶液的紫外吸收光谱(UV-2501PC紫外可见分光光度仪,Shimadzu Co.,Japan).

2.4 荧光发射光谱的测定

在激发波长为280nm,运用RF-5301型荧光光谱仪(Shimadzu Co.,Japan)分别测定不同组成条件下Hb的荧光发射光谱.激发、发射狭缝宽度均为3 nm.

2.5 冷冻蚀刻-透射电镜

冷冻蚀刻-透射电镜的样品在冷冻蚀刻仪(Balzers BAF-400D)中制得模板后,通过透射电镜(TEM, TECNAIL,Philip Apparatus Co.USA)观察囊泡的形貌.14

2.6 负染-透射电镜15

将含有囊泡的样品滴在200目Formvar膜的载网上,吸附15 min后,进行磷钨酸负染.通过透射电镜(TECNAIL,Philip Apparatus Co.,USA)观察囊泡的大小和形貌.

2.7 电导率的测定

体系的电导率由DDS-11A型电导率仪(上海第二分析仪器厂)测定.电导率仪每月均由0.01 mol· L-1KCl溶液校正.

2.8 圆二色性测定

蛋白的二级结构参数通过J-810型圆二色谱仪(Jasco Co.,Japan)测定蛋白体系的圆二色性(CD)而获得.蛋白的二级结构参数由所得蛋白CD图谱经Jasco标准图谱配合分析处理给出.扫描速率为100 nm·min-1.

2.9 Hb稳定性的测定

测量一系列不同时间、不同血红蛋白浓度时囊泡体系的紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和圆二色谱,通过分析各峰强和位置是否变化,确定蛋白的稳定性.

以上实验均在(25.0±0.1)°C条件下进行.为了使各相互间作用达到稳定平衡,体系稳定时间至少为30 min.

3 结果与讨论

3.1 Hb在Span 80/PEG 400/H2O囊泡体系中的紫外与荧光性质

由于Hb在肽链上含有色氨酸残基的吲哚环和酪氨酸残基的苯环,Hb紫外特征吸收峰主要落在276和406 nm.16在Hb/H2O体系中,随着Hb浓度增加,其紫外-可见特征吸收峰的强度呈线性增加(图1),这是紫外-可见光谱法测定Hb含量的基本原理. Hb在328 nm处的特征荧光发射峰强度,随Hb浓度的增加,先增大到一极值后又减小.这可能是由于随着Hb浓度增加,Hb可能发生二聚或团聚现象,导致其荧光强度下降.如果在PEG 400/H2O体系中加入Hb,Hb的紫外特征吸收峰强度和特征荧光发射峰强度与其在水体系中的性质相比,没有发生明显变化.但在Span 80/PEG 400/H2O囊泡体系中,Hb特征荧光峰强度明显增加.

PEG 400中含有较多亲水基(羟基),呈完全水溶性,可与Hb中亲水基(如氨基、羟基、羧基等)形成较强的氢键,聚集在Hb表面,但这种聚集没有导致Hb结构发生明显变化.在囊泡体系中,Hb与囊泡间的亲水作用、疏水作用和氢键作用,导致Hb易于吸附在囊泡表面,Hb的肽链在囊泡表面可逐渐展开,部分氨基酸残基可能更加暴露,特征荧光峰强度显著地增强.

图1 三种不同体系中Hb紫外吸收强度(a)和荧光强度(b)与Hb浓度关系Fig.1 Relations of UV-Vis absorption intensity(a)and fluorescence emission intensity(b)of Hb variy with Hb concentrations in three different systems■H2O system,●PEG 400/H2O system,▲niosome system; Insets are UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b).107cHb/(mol·L-1):(1)7.00,(2)9.00,(3)0.100,(4)0.300,(5),0.500,(6)0.700,(7)0.900

3.2 Hb/囊泡的聚集形貌

Hb在囊泡表面吸附或聚集的图像可以从囊泡/蛋白体系的FE-TEM照片(图2)和NS-TEM照片(图3、图4)得到证实.从图2可以看出,在囊泡体系中加入Hb后,原本均匀的球形囊泡结构呈现不均匀、多分散,不仅囊泡表观体积增大,而且不规则球形数目也增多.从图3、图4可以看出,在含有一定量的囊泡体系中,随着Hb浓度或PEG 400浓度的增加,囊泡逐渐相互连接在一起.大部分Hb通过亲水作用和氢键,17在囊泡膜表面吸附,肽链在囊泡膜表面逐渐展开,体系中蛋白相互聚集的程度也不断增加.随着PEG 400含量的增加,囊泡与蛋白间的亲水作用和氢键作用不断增强,蛋白在囊泡膜表面聚集增多,肽链进一步展开.

图2 囊泡体系(a)和Hb/囊泡体系(b)的冷冻蚀刻-透射电镜(FE-TEM)照片Fig.2 FF-TEM images of niosome system(a)and Hb/niosome system(b)

3.3 Hb对囊泡半径和ξ电位的影响

Span 80/PEG 400/H2O非离子囊泡半径为80-150 nm,其大小主要与温度、组成、制备方法等因素有关.18随着PEG 400含量增加,囊泡半径逐渐减小(图5).在含有Hb的囊泡体系中,囊泡的表观半径稍有增大,表明蛋白Hb吸附在囊泡膜表面.随着PEG 400含量的增加,PEG 400与Hb间的氢键和亲水作用能使更多PEG 400聚集在囊泡表面,囊泡表观半径稍有增加;但大量PEG 400又能引起囊泡膜的亲水性增强而不稳定,导致囊泡表观半径逐渐减小.图5还表明,吸附在囊泡表面的Hb,对囊泡能起到屏蔽、保护作用,能显著减小PEG 400对囊泡半径及其稳定性的影响.

PEG 400对囊泡/Hb体系中Hb、囊泡的动电位和体系电导率均有影响.Span 80/PEG 400/H2O非离子型囊泡自身无电荷,动电位为零,但当该体系中含有Hb时,实验发现囊泡呈现负电性、具有动电位(图6),其电荷性质与蛋白Hb相同,这表明带有负电性的Hb确实能吸附在非离子囊泡表面,使得非离子囊泡带电性.从图6还可以看出,随着PEG 400含量增加,体系的电导率减小.PEG 400含量增加,体系粘度增强,PEG 400与囊泡间的相互作用增强,使得带电粒子在电场下运动速率减小,电导率减小, Hb的表观负电荷和动电位也都减小.另外,PEG 400中羟基与蛋白间形成氢键,使Hb发生部分扭曲和伸长,电荷密度减小,二级结构发生改变,其电性也可能发生变化.

3.4 囊泡体系中Hb的园二色性及其二级结构参数

图3 Hb/囊泡体系NS-TEM照片Fig.3 NS-TEM images of Hb/niosome systemwPEG400=2.0%;106cHb/(mol·L-1):(a)1.00,(b)5.00,(c)8.00,(d)0.10,(e)0.30,(f)0.50

图4 Hb/囊泡体系NS-TEM照片Fig.4 NS-TEM images of Hb/niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;wPEG400/%:(a)1.0,(b)2.0,(c)3.0,(d)4.0,(e)5.0,(f)7.0

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡体系中,Hb的二级结构发生明显地变化,19,20α-螺旋结构含量减少,β-折叠和β-转角结构含量增加,无规卷曲结构含量基本不变(图7).由于蛋白与囊泡间亲水作用、疏水作用和氢键作用使Hb能够吸附于囊泡膜表面,蛋白的肽链在囊泡膜表面逐渐伸展.另外,PEG 400具有很强亲水性,能够嵌入到囊泡的膜相中,使得囊泡膜的亲水性和粘性增强,蛋白与囊泡间亲水作用和氢键作用也增强,蛋白在囊泡膜表面的含量增加,引起蛋白肽链折叠结构松散,处于蛋白折叠结构内部的部分基团暴露,甚至在囊泡膜表面进一步展开,二级结构发生改变.

3.5 Hb在PEG 400水溶液和囊泡体系中的稳定性

图5 PEG 400含量对囊泡半径(Rh)的影响Fig.5 Effect of PEG 400 content on hydrodynamic radius(Rh)of niosome cHb=5.00×10-6mol·L-1

图6 PEG 400含量对Hb/囊泡体系电导率的影响Fig.6 Effect of PEG 400 content on conductivity ofniosome system cHb=5.00×10-6mol·L-1

图7 PEG 400含量对囊泡体系中Hb的二级参数的影响Fig.7 Effect of PEG 400 content on secondary parameters of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1

图8 Hb在囊泡体系中的稳定性Fig.8 Stability of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;■Hb/niosome system,●Hb/PEG 400/H2O system

Hb对囊泡的大小和稳定性影响较小,但囊泡的存在有利于Hb性质的稳定(图8).由于Hb能够吸附于囊泡膜表面,稳定了蛋白的结构,部分保护了蛋白.所以,虽然Hb在囊泡体系中与在纯水体系中相比其结构发生一定的变化,但其稳定性显著增加.从图8还可看出,Hb的稳定性随着PEG 400含量的增加先增加、后下降,这可能与囊泡的稳定性有关.具有亲水链的PEG 400环绕在囊泡中,部分存在于囊泡的膜相中,使得囊泡具有较高的稳定性.另一方面,当体系中PEG 400含量较高时,PEG 400含量增加使得囊泡的亲水性增加,囊泡膜厚度减小,囊泡稳定性减小,引起Hb结构变化、稳定性降低.

4 结论

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡体系中,Hb能够吸附于囊泡膜表面,使得蛋白的肽链在囊泡膜表面逐渐伸展,二级结构发生变化,Hb电性质和稳定性也发生改变.随着PEG 400含量的增加,囊泡与蛋白间相互作用逐渐增强,蛋白在囊泡膜表面聚集增多.Hb在Hb/囊泡体系中的稳定性较在Hb/H2O体系中的稳定性高.而当蛋白浓度逐渐增加时,越来越多的囊泡通过蛋白而相互聚集.研究非离子型表面活性剂囊泡体系中的蛋白结构性质,囊泡与蛋白间的相互作用,分析PEG 400对囊泡与蛋白间相互作用的影响,能够为生命体系中囊泡与蛋白间的相互作用与影响以及生物膜与蛋白间的相互关系等提供实验依据,也能够为生物膜的功能性研究和应用提供可靠的理论依据.

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February 28,2011;Revised:May18,2011;Published on Web:June 21,2011.

Structural Property of Hemoglobin in Span 80/PEG 400/H2O Niosome System

WANG Yuan-You1,2HUA Wei1LIU Tian-Qing1,*
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225002,Jiangsu Province,P.R.China;2Department of Chemical Engineering,Yangzhou Polytechnic Institute,Yangzhou 225127,Jiangsu Province,P.R.China)

The structural property of hemoglobin(Hb)was studied in detail by UV-Vis absorption, fluorescence,circular dichroism,negative staining-transmission electron microscopy(NS-TEM),and freeze etching-transmission electron microscopy(FE-TEM)techniques using a Span 80/PEG 400/H2O niosome system.The obtained results show that Hb is adsorbed onto the surface of niosome.The peptide chain of Hb spreads out and the apparent radius of the niosome,the intensities of the UV-Vis absorption peaks,and the fluorescence peaks increase.For the second structural parameter of Hb,the α-helix content decreases but the β-sheet and β-turn content increases.The stability of Hb varies with that of the niosome.

Hemoglobin;Structure;Property;Niosome

O648

*Corresponding author.Email:tqliu@yzu.edu.cn;Tel:+86-514-87975590-9517;Fax:+86-514-87975244. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20573091).

国家自然科学基金(20573091)资助项目

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