一株鸽新城疫病毒的分离鉴定

范建华 刘华雷 刘学贤 徐 步*

（1.中国农业科学院家禽研究所，扬州 225003；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032）

鸽新城疫又称鸽I型副粘病毒病（PPMV-1），是目前危害我国养鸽业的一个主要烈性传染病。发病鸽多见于25～50日龄的青年鸽，以拉绿色粪便、扭头、翅膀下垂等为主要临床表现。发病率可高至70%。急性发病期，如果有其他细菌性疾病和寄生虫病伴发，死亡率可达到30%。本实验主要针对江苏省某规模化鸽场的发病情况，及时采取病死鸽的脑、脾脏等组织进行了病毒分离和鉴定，以及相关的生物学特性研究，旨在探明该鸽场鸽病发生原因，进一步了解鸽新城疫的发病机理和寻求防控策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 试验鸡和鸡胚 SPF鸡胚购自山东家禽所，SPF雏鸡在中国动物卫生与流行病学中心孵化、饲养。

1.1.3 标准阳性血清 NDV、AIVH5、H9和EDSV标准阳性血清，均购自中国兽药监察所。

1.1.4 试验用菌株和质粒 E．coli DH5α和pGEM-T Easy载体均由中国动物卫生与流行病学中心提供。

1.1.5 试验用试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒IPTG、X-gal、RNA 酶抑制剂、EcoR I和DNA Marker DL2000、氨苄青霉素和DEPC均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离、噬斑纯化 参照文献[4]方法进行。

1.2.2 血清学鉴定 用β-半数微量法测定尿囊液HA效价，用NDV、H5、H9、EDS-76标准阳性血清进行HI试验。

1.2.3 病毒毒力测定 MDT和ICPI测定：参照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(SN/T111022002) 规定的标准方法进行。

1.2.4 引物设计、合成和基因测序 根据GenBank上已发表的NDV F基因全基因序列，利用primer 5.0软件自行设计了引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列为：P1：5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′，P2：5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′，扩增产物经常规方法连接、转化、鉴定后测序。

1.2.5 同源性比较和进化树分析 利用MEGA4.0软件对所测序列和GenBank上已公布的NDV毒株序列进行比较，根据F基因ORF 1-389nt之间的核苷酸序列构建进化树和基因分型，并分析裂解位点的氨基酸组成。

2 结果

2.1 病毒分离、纯化结果

病毒接种SPF鸡胚，48h以后全部出现死亡，死亡鸡胚胚体均表现弥漫性出血，尤以胚的头部、肝脏和肾脏出血严重；病毒前2代细胞噬斑出现时间、大小不一，到第3代以后噬斑出现时间是48h以内，大小较均匀。

2.2 血清学鉴定结果

病毒连续传至第3代以后，HA效价稳定在在8㏒2以上；HI试验表明，该分离病毒的红细胞凝集性可被NDV抗血清抑制， AIVH5、AIVH9及EDS-76阳性血清表现阴性，初步鉴定为新城疫病毒感染。

2.3 病毒毒力测定结果

2.3.1 MDT测定结果 取10-6～10-9稀释度分离、纯化的病毒，每个稀释度接种5只10日龄SPF鸡胚，0.1 ml/只，照蛋3次/d，间隔8h，共观察7d，记录鸡胚死亡时间，结果详见表1。结果表明，引起鸡胚死亡的最高稀释度(MLD)在10-7，计算得MDT为129.6h。

表1 SPF 鸡胚接毒后死亡情况

2.3.2 ICPI测定结果 取1日龄雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释度的纯化尿囊液0.05 ml。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05 ml。接种后，每天在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常（活动灵活，行动无共济失调现象）、发病（包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡）和死亡。观察8d（结果见表2），计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值（正常为0、发病为1，死亡为2），累计总分数，计算得ICPI为0.287。

表2 1日龄SPF鸡脑内接种后发病情况

2.4 F基因测序结果

经一步法RT-PCR，获得1条约500bp的特异性扩增条带，与预期扩增的目的片段大小相符(见图1) 。应用MEGA4.0软件分析测序结果，推导其氨基酸序列，发现该毒株F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117，与NDV强毒株的特征性结构相符。

图1 NDV F 基因的RT-PCR扩增产物

2.5 同源性分析结果

应用MEGA4.0软件，将P3株与GenBank中已公布的具有代表性的NDV毒株F基因ORF 1-389nt之间核苷酸进行同源性比较分析，结果见表3。其中，与Lasota株的同源性最高，核苷酸序列同源性达99.9%，转译氨基酸的同源性达100%；与Kuwait 256株的同源性最低，核苷酸序列同源性达86.3%，转译氨基酸的同源性达84.1%。

表3 P3株与GenBank中部分已公布的NDV代表株F基因核苷酸和氨基酸的同源性比较

2.6 系统发育进化树

根据F基因ORF的1-389bp序列，应用MEGA4.0软件对GenBank中已公布的NDV毒株与本实验分离毒株的F基因进行序列比对分析，绘制了系统发育进化树(见图2)。本实验分离株在分类地位上属于基因II型。

图2 新城疫F基因片段（389bp）遗传进化树（注：本实验中的分离株用▲标出）

3 讨论与分析

（1）鸽新城疫是鸽子常见的病毒性疾病之一。我国自1981年广东省拱北首例鸽新城疫发生以来，该病很快传播至东南沿海城市。近年来，我国内陆城市和地区也陆续有鸽新城疫的病例报道。江苏省是鸽业养殖的一个重要省份，随着养殖规模化，鸽新城疫屡有发生。本实验所用的鸽新城疫病毒是从江苏省内某规模化肉鸽场分离。该鸽场共有10棚青年鸽，自发病以来，发病率和死亡率急剧上升。笔者结合常规血清学方法和分子生物学手段确诊该病例为鸽新城疫弱毒株感染，从分类地位上属于基因型Ⅱ型，从核苷酸和转译氨基酸组成来看与传统LaSota株的同源性最高，与Kuwait256株同源性最低，这可能与该分离病毒的始原和传代次数有关。但从MDT和ICPI的测定数据，以及F基因序列特征结构等来看，不能确定其为LaSota疫苗株的变异，这与有关文献报道不一。

（2）早在1978年鸽新城疫首次发生以来，Collins[1]等人就认为鸽新城疫的毒力和致病性与F基因序列特征结构相关，但近年来的争议较多。Pearson[3]等从鸽分离的10株新城疫病毒进行毒力型测定时，发现这10株鸽分离物至少相当于鸡新城疫中的中发型毒株，但其最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间(MDT)最低值为98h，与鸡的中发型毒株的MDT小于90h又表现出不一致。而且，这几株分离物通过泄殖腔、鼻腔或肌肉注射时不使鸡发病；J. C. F. M. Dortmans[11]等构建了1株PPMV-1，标号为AV324。然而AV324株对鸡没有致病性，但其F基因转译氨基酸的组成具备典型的强毒株特征性结构，即“112RRKKRF117。本实验分离株，MDT＞90h，ICPI ＜0.5，符合弱毒株的特征性结构，而F基因转译氨基酸的组成（112R-R-QK-R-F117）又符合强毒株特征。因此，鸽新城疫的毒力和致病性不能完全由新城疫的F基因裂解位点的特征性结构决定。

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