杏子果肉多酚超声波辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究*

王雅，马重华，郭涛，李家寅，周尚臻，何海宁，王晓兰

1(兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730050)2(兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州，730050)

杏子果肉多酚超声波辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究*

王雅1，马重华2，郭涛1，李家寅1，周尚臻1，何海宁1，王晓兰1

1(兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730050)2(兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州，730050)

以杏肉多酚为研究对象，采用超声辅助提取方法，通过单因素实验和响应曲面设计优化其提取工艺，用还原力和DPPH·清除能力对其抗氧化活性进行研究。用Design Expert软件分析确定杏肉多酚适宜提取工艺为:料液比1∶12(g∶mL)，乙醇体积分数71%，超声功率364 W，超声时间17 min。在此条件下杏子果肉多酚提取率达9.39%;4个因素对杏肉多酚提取率影响的主次顺序为:超声功率＞料液比＞乙醇浓度＞超声时间;还原力和DPPH·清除能力表明，杏肉多酚具有较强的抗氧化活性，但在相同质量浓度下，杏肉多酚的抗氧化活性小于Vc。

杏肉，多酚，超声波辅助提取，响应曲面法，抗氧化活性

杏子，又名甜梅、杏，英文为apricot，拉丁语学名为Prunus armeniaca，为蔷薇科李属李亚属植物，含有多种生物活性物质和人体必需的维生素及无机盐类，是一种营养价值较高的水果［1］。杏肉多酚是杏肉中所含多元酚类物质的总称，研究表明多酚类物质在抗氧化、清除自由基、抑菌、抗癌、抗衰老、降血糖、降血脂、预防心血管疾病等方面具有独特的生理功效［2］，目前对杏肉的开发应用主要在饮料和杏脯的研究上，而对杏肉多酚的提取及抗氧化活性研究报道较少，只见到熊素英等［3］和马景蕃［4］等分别对小白杏和香白杏多酚化合物的提取及抗氧化功能进行了初步研究，因此，本文通过超声波辅助提取和响应面设计优化了杏肉多酚的提取工艺，并对纯化后的杏肉多酚进行了抗氧化活性研究。

1 材料与方法

1.1 原料

杏(红玉杏)，2011年6月于购于甘肃西太华超市，去核，干燥粉碎，备用。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇(天津市百世化工有限公司)，没食子酸(Sigma-Aldrich)，Vc(抗坏血酸莱阳市双双化工有限公司)，DPPH(二苯代苦味酰基自由基)(Sigma-Aldrich)，NKA-9大孔树脂(南开大学化工厂)。

超声波细胞粉碎机(JY92-Ⅱ)，宁波新芝生物科技股份有限公司;紫外可见分光光度计(UV-9200)，北京瑞利分析仪器公司;真空冷冻干燥机(FD-1-55)，北京博医实验仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 没食子酸标准曲线的绘制［5－6］

用5 mL乙醇溶解0.2 500 g没食子酸标准品，用去离子水定容至50 mL。分别移取 0、0.5、1.0、1 .5、2.5 mL没食子酸溶液到50 mL容量瓶中，用去离子水定容，配制成质量浓度为 0、50、100、150、250 mg/L的没食子酸标准溶液。从上述不同质量浓度的没食子酸标准溶液中分别移取1 mL，加入到50 mL比色管中。加入2.5 mL Folin-C试剂，混合。在0.5～8 min内加入10mL质量分数10%的碳酸钠溶液，混合，用去离子水定容至1 000 mL。将上述标准溶液在20℃放置1 h后，用紫外分光光度计进行全波长扫描，在最大吸收峰下测定吸光度，以没食子酸标准品溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。吸光度值Y与没食子酸标准溶液质量浓度X(mg/mL)之间的回归关系为:Y=3.130 3X +0.0163，R2=0.996 7。

2.2 杏肉多酚的提取和测定

称取2.000 g杏肉，加入一定浓度的乙醇溶液浸泡0.5 h，以一定的料液比和超声功率超声一定时间，离心，取上清液减压浓缩，按照标准曲线的测定方法测其吸光度，计算多酚的提取率，每个试验重复3次。

2.3 响应曲面优化杏肉多酚提取工艺

在单因素试验结果基础上，采用中心组合试验Box-Behnken［7－9］设计方案，以料液比(a)、乙醇浓度

(b)、超声功率(c)和超声时间(d)，并以 +1、0、－1分别代表变量的水平，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应曲面优化杏肉多酚提取工艺的因素与水平

2.4 杏肉多酚的制备

将杏肉多酚提取液离心后减压浓缩，经NKA-9大孔树脂纯化，用不同浓度的乙醇溶液洗脱后，减压浓缩，真空冷冻干燥后测其纯度为77.32%。

2.5 杏肉多酚的抗氧化性能测定

2.5.1 还原能力的测定

采用铁氰化钾还原法评价杏肉多酚还原能力［5］。在不同浓度的沙米绿原酸溶液中加入2.5 mL(0.2 mol/L pH=6.6)的磷酸盐缓冲液，加入2.5 mL 10 g/L铁氰化钾，混匀，50℃恒温20 min，加2.5 mL 100 g/L三氯乙酸，离心(3 000 r/min)10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL蒸馏水，加0.5 mL 1 g/L三氯化铁，于700 nm波长测定吸光度。用对应浓度的Vc作还原能力比较试验。

2.5.2 对DPPH自由基清除能力［10－12］

待测液的制备:配制质量浓度为0.025 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液，再分别配制质量浓度为0.000 2、0.000 4、0.000 6、0.000 8、0.001、0.002、0.003和0.003 5 mg/mL的杏肉多酚溶液。

对DPPH溶液进行扫描，确定最大吸收波长为517 nm。以无水乙醇为对照，精确吸取DPPH溶液2.5 mL，与2.5 mL无水乙醇混合，以无水乙醇为对照，测定溶液在517 nm处的吸光度值(A0)。

精确吸取上述不同浓度的杏肉多酚溶液2.5 mL，分别与质量浓度为0.025 mg/mL DPPH溶液2.5 mL混合，摇匀后放置30 min。以无水乙醇为对照，测定上述溶液在517 nm处的吸光度值(Ai)。

精确吸取上述不同浓度的杏肉多酚溶液2.5 mL，分别与2.5 mL无水乙醇混合均匀，以无水乙醇为对照，测定各溶液在517 nm处的吸光度值(Aj)，计算清除率。得到清除率在一定浓度范围的回归方程，通过线性方程计算IC50(DPPH清除率为50%时所对应的样液浓度)。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 料液比对杏肉多酚提取率的影响

在超声时间15 min、超声功率320 W、乙醇体积分数 70%，分别用 1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20的料液比提取，以考察料液比对杏肉多酚提取率的影响。图1表明，随料液比的增大，多酚提取率不断增大，在料液比为1∶12时多酚提取率达最高，之后随料液比的增大多酚提取率降低，另外，料液比增大，会增大提取成本，因此，取最佳料液比为1∶12。

图1 料液比对多酚提取率的影响

3.1.2 乙醇浓度对多酚提取率的影响

在超声时间15 min、超声功率320 W、料液比1∶12，选取不同体积分数(40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的乙醇提取。图2表明，随乙醇浓度的增加，杏肉多酚提取率不断增大，当乙醇体积分数为70%时，杏肉多酚的提取率最大。因此，最佳乙醇体积分数为70%。

图2 乙醇浓度对多酚提取率的影响

3.1.3 超声功率对杏肉多酚提取率的影响

在超声时间15 min、料液比1∶12、乙醇溶液体积分数 70%，分别用 80、160、240、320、400 W 的超声功率提取。图3表明，随超声功率的增加，多酚提取率不断增加，当超声功率达到320 W时，多酚的提取率达到了最大，超声功率继续增大，多酚的提取率反而下降，可能是较大的超声功率会破坏部分多酚的结构，导致其含量下降，因此，最佳超声功率为320 W。

图3 超声功率对多酚提取率的影响

3.1.4 超声时间对杏肉多酚提取率的影响

在超声功率320 W、料液比1∶12、乙醇体积分数70%，分别用 5、10、15、20、25、30 min 的超声时间提取。图4表明，随超声时间的增加，多酚提取率不断增大;当超声时间达到15 min时，多酚的提取率达到最大，之后随时间的增加，可能是部分多酚被氧化而使提取率下降，另外，超声时间越长能耗越大，因此，最佳超声时间为15 min。

图4 超声时间对多酚提取率的影响

3.2 响应曲面试验模型建立与显著性检验

3.2.1 回归模型的建立及统计检验响应曲面优化

设计并优化的29组试验安排及试验结果见表2，采用软件Design-Expert 7.1.4对所得数据进行回归分析，结果见表3、表4。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明模型差异极显著。模型的决定系数R2=0.900 9，说明用该模型可以解释90.09%响应值的变化。该模型拟合程度良好，试验误差小，可用此模型对杏肉多酚提取工艺进行分析和预测。

由表4可知，二次项a2和b2对多酚提取率的影响极显著，二次项d2和交互项ab对多酚提取率的影响高度显著，一次项a、c，二次项c2和交互项ac、ad对多酚提取率的影响显著。依据参数估计值知影响因子的主效应顺序:超声功率＞料液比＞乙醇浓度＞超声时间。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

表3 回归模型的方差分析

表4 回归模型系数的显著性检验

为进一步确定最佳点的数值，对回归方程取一阶偏导数，并令其等于零，得如下方程:

0.13 －0.9A+0.34B－0.28C－0.27D=0(1)

0.09 +0.34A－1.08B－0.022C+0.15D=0(2)

0.15 +0.28A－0.022B－0.36C+0.2D=0(3)

0.074 －0.27A+0.15B+0.2C－0.56D=0(4)

解得A=－0.114;B =0.093;C=0.549;D=0.408，代入编码公式得多酚提取的最佳工艺:a(料液比)=1∶11.77 g/mL;b(乙醇浓度)=70.93%;c(超声功率)=363.92 W;d(超声时间)=17.04 min。

3.2.2 模型验证

结合回归模型的数学分析结果，超声波辅助提取杏肉多酚的最佳工艺参数为:料液比1∶12 g/mL，乙醇浓度71%，超声功率364 W，超声时间17 min。在此条件下杏肉多酚理论提取含量为9.36%，实际杏肉多酚提取含量为9.39%，两者非常接近，说明该模型可靠。

图5显示，当料液比为1∶12，超声功率为320 W时，乙醇浓度和超声时间对杏肉多酚提取率的交互作用。当乙醇浓度一定时，随着超声时间的延长，杏肉多酚提取率提高，但超声时间超过一定值时，杏肉多酚的提取率呈下降趋势。当超声时间一定时，杏肉多酚提取率随乙醇浓度的增大呈先升高后下降的趋势。

图5 乙醇浓度及超声时间对多酚提取率交互作用的等高线图及响应面

图6 显示当超声时间为15 min，超声功率为320 W时，料液比和乙醇浓度对杏肉多酚提取率的交互作用。当乙醇浓度一定时，随着料液比的增大，杏肉多酚提取率提高，但料液比超过一定值时，杏肉多酚的提取率呈下降趋势。当料液比一定时，杏肉多酚提取率随乙醇浓度的增大呈先升高后下降的趋势。

图6 料液比及乙醇浓度对多酚提取率交互作用的等高线图及响应面

图7 显示，当乙醇浓度为70%，超声功率为320 W时，料液比和超声时间对杏肉多酚提取率的交互作用。当料液比一定时，随着超声时间的延长，杏肉多酚提取率提高，但超声时间超过一定值时，杏肉多酚的提取率呈下降趋势。当超声时间一定时，杏肉多酚提取率随料液比的增大呈先升高后下降的趋势。

图7 料液比及超声时间对多酚含量交互作用的等高线图及响应面

3.3 杏肉多酚的抗氧化活性

3.3.1 还原力

由图8可知，杏肉多酚的还原力随质量浓度的增大而增大，且相同质量浓度下杏肉多酚的还原力小于Vc。通常情况下，样品的还原力与抗氧化活性之间有显著的相关性，其还原力越强，则物质的抗氧化性越强，说明杏肉多酚的抗氧化性小于Vc。

图8 杏肉多酚与VC还原力的比较

3.3.2 杏肉多酚清除DPPH·的能力

通过图9可知，随着浓度的增大，杏肉多酚清除DPPH·的能力逐渐增强，在相同质量浓度下，杏肉多酚清除DPPH·的能力低于Vc。由表5可知，杏肉多酚的IC50大于Vc的IC50，说明其对DPPH·的清除能力比Vc弱，即杏肉多酚的抗氧化性小于Vc。

图9 杏肉多酚和VC清除DPPH·能力

表5 杏肉多酚和Vc的IC50值比较

4 结论

(1)通过单因素试验和响应曲面法可知杏肉多酚的最佳提取条件为:料液比1∶12(g∶mL)，乙醇体积分数71%，超声功率364 W，超声时间17 min。在此条件下杏肉多酚理论提取含量为9.36%，在此条件下杏肉多酚理论最大提取率为9.36%，实际最大提取率为9.39%;影响杏肉多酚超声波辅助提取的主次因素顺序为超声功率＞料液比＞乙醇浓度＞超声时间。

(2)体外抗氧化试验研究表明:杏肉多酚有较强的还原力和清除DPPH·的能力，说明杏肉多酚具有一定的抗氧化活性，但在相同质量浓度下杏肉多酚的抗氧化活性弱于Vc。

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Optimization of Polyphenol Ultrasonic Assisted Extraltion from Apricot Pulp and Its Antioxidant Activities

Wang Ya1，Ma Chong-hua2，Guo Tao1，Li Jia-yin1，Zhou Shang-zhen1，He Hai-ning1，Wang Xiao-lan1
1(College of life science and engineering，Lanzhou university of Technology ，Lanzhou 730050，China)2(College of Petrochemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China)

The ultrasonic assisted extraction technology of apricot pulp polyphenol was studied.The optimal conditions were determined by mono－factor experiment and response surface analysis.The antioxidant activity of apricot pulp polyphenol was studied by using reducing power and clearance ability for DPPH?.The result indicated that the optimum extracting conditions of apricot pulp polyphenol were as follows:the ratio of solid to liquid 1∶12，concentration of ethanol 71%，the ultrasonic power 364w and the extraction time 17 min.under the above extracting conditions，the extraction rate of apricot pulp polyphenol was 9.39% .The influence effect of four factors to the extraction rate of apricot pulp polyphenol were ultrasonic power＞ liquid ratio＞ concentration of ethanol＞ ultrasonic time.The apricot pulp polyphenol had strong antioxidative activity.However，its antioxidative activity was lower than Vc in the same concentrations.

Canarium album ( Lour． ) Rauesch，phenolic extracts，antioxidant capacity

博士研究生，副教授(郭涛为通讯作者)。

*杏仁产品的研发与综合利用(H1008cc003)，兰州理工大学“学科协调发展计划”现代生物药物合成药物的研究与开发资助

2011－07－25，改回日期:2011－1025－