甘薯叶总黄酮含量的测定*

李光，余霜，邓银，陈庆富

1(安顺学院化学与生物农学系，贵州安顺，561000) 2(安顺学院资源管理与环境科学系，贵州安顺，561000)3(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳，550001)

甘薯叶总黄酮含量的测定*

李光1，3，余霜2，3，邓银3，陈庆富3

1(安顺学院化学与生物农学系，贵州安顺，561000) 2(安顺学院资源管理与环境科学系，贵州安顺，561000)3(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳，550001)

为了研究甘薯叶总黄酮含量测定方法，文中采用超声波辅助提取甘薯叶中的总黄酮，通过波长扫描确定了AlCl3-KAC显色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法的最大吸收峰波长分别为360nm和500nm;比较了分光光度法2种空白对照的制作方法对实验结果的影响，最终根据测量值的标准误差、标准差、方差、峰度、偏度等指标确定最适显色法。结果表明:波长在500 nm处以蒸馏水为空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法是甘薯叶总黄酮含量测定的最适方法，该法稳定性好，操作简便，对甘薯其他部位总黄酮含量测定有较好的参考价值。

甘薯，黄酮含量，测定方法

甘薯，又称红薯、番薯和地瓜，属旋花科植物，原产于美洲中部和南美洲西北部的热带地区［1］。现广泛种植于中国各地，目前中国甘薯的常年种植面积占世界总种植面积的80%以上。甘薯通常以食用块根为主，我国每年近亿吨的甘薯茎叶(除部分地区作为饲料外)多数被抛弃掉，造成资源浪费和环境污染。所以、对甘薯藤叶进行资源化利用，有较好的社会效益和经济价值。

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用［1］。关于黄酮类物质的测定，常采用比色法和HPLC法。由于HPLC法仪器昂贵，标准对照物的较难获得，其应用受到一定的限制。而比色法方便简单，结果准确，应用较广，黄酮测定用到的分光光度法主要有AlCl3-KAC显色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法2种，但是在已有报道中，这2种方法都被用于甘薯黄酮测定，本研究通过对2种分光光度法的比较，确定了甘薯叶的总黄酮最适测定方法，取得了满意的实验结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘薯叶，采自贵州师范大学植物遗传育种研究所。芦丁标准品，购自贵州迪大生物有限公司;其他试剂为分析纯。

DHG-90A(101AB)干燥箱，上海索谱仪器有限公司;紫外可见分光光度计 UV-1800，岛津公司;AR1140电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司;WB-400小型高速粉碎机，北京维博创机械设备有限公司;TDL-5C型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;AKJY-20超纯净水机，艾柯;KQ-250DE型数控超声波清洗机，昆山超声仪器有限公司;PHS-3C型酸度计，上海虹仪仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄酮的提取

取100 g甘薯叶60°C烘至恒重，粉碎后过40目，准确称取0.3 g干粉，溶于体积分数为60%的乙醇中，固液比 1∶20(g∶mL)，温度 40°C，每次 20 min，提取3次，超声波功率178.5 W，超声提取前静置5 min，提取液2 000 r/min离心3 min，合并提取液即为黄酮提取液。

1.2.2 两种测定方法的波长扫描

1.2.2.1 AlCl3-KAC显色法

AlCl3-KAC显色法参考文献［3］，并稍作改动。准确吸取提取液1 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl32 mL、1 mol/L乙酸钾3 mL，最终用甲醇溶液定容至10 mL，摇匀，室温下放置30 min。在4 000/min速度下离心10 min，在200～1 000 nm区间内进行波长扫描，根据最大吸收峰确定测定波长。

1.2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法参照文献［4］，并稍作改动。准确吸取提取液1 mL，依次加入2mL

去离子水、0.5 mL质量分数5%亚硝酸钠混合，振荡后静止放置6 min，加入0.5 mL质量分数10%硝酸铝，振荡后静置6 min，然后加入2.5 mL质量分数5%NaOH，振荡后静置15 min.最后用去离子水定容至9 mL，在200～1 000 nm区间内进行波长扫描，根据最大吸收峰确定测定波长。

1.2.3 两种测定方法结果的比较

本研究采用2种空白对照的制作方法:方法(1):以蒸馏水为空白;方法(2):空白对照不添加显色剂(AlCl3或Al(NO3)3)，其他试剂与样品制作时添加的相同。将样品的吸光度值减去空白对照的吸光度值获得吸光度值，以最终获得吸光度值。最后运用SPSS17.0对2种方法获得的吸光度值进行统计分析，对比2种方法的优劣。

2 结果

2.1 两种测定方法的波长扫描结果

通过对2种测定方法进行的波长扫描(见图1)，AlCl3-KAC显色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法最大吸收峰对应的波长分别为361、498 nm，故2种方法测定时选取的波长分别为360、500 nm。

图1 两种测定方法的波长扫描图

2.2 两种测定方法结果的比较

由图2、图3知，单从样品的吸光度值测定曲线看，AlCl3-KAC显色法稳定性明显强于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法。样品的吸光度值减去空白对照的吸光度值获得最终的测定结果，由图4知，以蒸馏水为空白对照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法在600 s内吸光度值的标准误差、标准差、方差、峰度、偏度等指标上均优于其他曲线(见表1)，可见、甘薯叶总黄酮含量测定最适方法为以蒸馏水为空白对照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法。

图2 AlCl3-KAC显色法吸光度值随时间变化图

图3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法吸光度值随时间变化图

图4 600 s内测量值变化曲线

表1 两种测量方法吸光度值的统计分析

3 讨论与结论

可见及紫外分光光度法是黄酮测量常用的方法，该方法有操作简便、检测成本低的优点，当前使用较多的可见及紫外分光光度法有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法和 AlCl3-KAC显色法 2种，而由于AlCl3-KAC显色法获得的黄酮含量的测量值比实际的要低，所以，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法的使用更为普遍，大约70%的已有报道使用该法。在已有报道中分光光度法空白对照的制作方法有2种:方法(1)以蒸馏水为空白;方法(2)空白对照不添加显色剂［本研究为AlCl3或Al(NO3)3］，其他试剂与样品制作时添加的相同。在这2种制作方法中，方法(1)是早期常用到的空白制作方法，而方法(2)排除了显色剂以外试剂的影响，被认为是改进的和更好的空白对照制作方法，但在本研究中使用空白对照制作方法(1)的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法表现出更好的稳定性。另外、本研究对2种测量方法进行的波长扫描(200～1 000 nm)，确定了 AlCl3-KAC显色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法最大吸收峰波长分别为:360、500 nm。故在500 nm处以蒸馏水为空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法是甘薯叶总黄酮含量测定的最适方法，该法可以为甘薯其他组织中总黄酮含量的测定提供参考。

［1］ 中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1979，64(1):88 －90.

［2］ 延玺，刘会青，邹永青，等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展［J］.有机化学，2008，28(9):1 534 －1 544.

［3］ NY/T1295－2007.荞麦及其制品中总黄酮含量的测定［S］.

［4］ 杨磊，贾佳，祖元刚.山楂属果实提取物的体外抗氧化活性［J］.中国食品学报，2009，9(4):28－32.

Study on the Determination of Flavonoid in Sweet Potato Leaves

Li Guang1，3，Yu Shuang2，3，Deng Yin3，Chen Qin-fu3
1(Department of Chemistry and Biological Agronomy，Anshun University，Anshun，561000，China)2(Department of resource and environment，Anshun University，Anshun 561000，China);3(School of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)

Ultrasonic-assisted method was used to extract flavonoids from Sweet Potato leaves.By the wavelength scan，we found that the maximum absorption peak wavelength of AlCl3-KAC colorimetric method is 360 nm and the maximum absorption peak wavelength of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method is 500 nm.The two different blank controls by spectrophotomretry on final the results were compared.The best methods was selected based on standard error，standard deviation，variance，kurtosis and partial degree.The results show that NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method at the wavelength of 500 nm with distilled water as blank is the best way.This method is reproducible and convenient，and can be used to detect flavonoids contents in other parts of Sweet Potato.

sweet potato，flavonoids contents，measuring method

博士研究生，讲师(陈庆富教授为通讯作者，E-mail:cqf1966@163.com)。

*贵州省农业攻关项目(黔科合NY字［2010］3014)

2011－08－22，改回日期:2011－11－07