巨噬细胞因子daintain激活血液炎症反应

赵燕英，汪俊汉，陈正望

1西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041;2华中科技大学生命科学与技术学院; 3华中科技大学校医院，武汉430074

巨噬细胞因子daintain激活血液炎症反应

赵燕英1，2*，汪俊汉3，陈正望2

1西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041;2华中科技大学生命科学与技术学院;3华中科技大学校医院，武汉430074

Daintain是我们鉴定并命名的巨噬细胞炎症因子。多个小组的研究表明daintain与炎症密切相关，但截至目前尚缺乏两者关联的直接证据。本实验研究了daintain对昆明鼠血液C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和纤维蛋白原的影响，结果表明daintain促进血液CRP的增高，激活纤维蛋白原，此外还观察到daintain增加了血液粘度并加速血液凝固。这些结果提示daintain可直接激发血管炎症反应，可能促进心血管疾病的发生。

daintain;C反应蛋白;纤维蛋白原;炎症

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动应激反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等［1，2］。血管反应是炎症过程的中心环节。

二十世纪90年代中期，我们在研究胃肠多肽激素对胰腺β细胞分泌影响的时候，从猪小肠中分离鉴定出了一个蛋白，命名为daintain(Da，大big;in，炎症 inflammatory;tai，肽 peptide;in，因子 factor)［3，4］，不同小组研究表明细胞因子干扰素γ可上调其转录水平，daintain是巨噬细胞激活过程中的一个免疫调节器［5］;daintain对于巨噬细胞的存活和前炎症(pro-inflammatory)活力至关重要［6］;而抑制daintain的表达减弱了动脉粥样硬化刺激的巨噬细胞的迁移、增生和信号转导［7］。这些研究都显示了daintain与炎症的密切关系。但尚缺乏daintain促进炎症反应的直接证据。本文拟探讨daintain在血管中对炎症反应的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料

10周龄昆明鼠购自湖北省实验动物中心，丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、SDS、过硫酸胺、TEMED、溴酚兰、考马斯亮蓝R-250、β-2-巯基乙醇均购自Bio-Rad公司，NC膜购自Millipore公司，化学发光剂购自Pierce，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司，蛋白电泳仪转膜系统购自Bio-Rad公司。

临床化学分析仪CL-8000S购自日本HIMADZU公司，纤维蛋白原由Sysmex株式会社CA系列全自动凝血分析仪检测，纤维蛋白原检测试剂盒购自德国Dade Behirng公司。

1.2 实验方法

1.2.1 daintain纯化和鉴定

按照先前报道的方法［2］纯化daintain。主要过程包括组织切碎、高温灭活蛋白酶、稀醋酸浸提、海藻酸吸附、NaCl盐析、异丙醇分级提取、Sephadex G25凝胶过滤、DEAE纤维素离子交换层析和多次高效液相色谱法纯化。将纯化组分经12%SDSPAGE分离，考马斯亮蓝染色;另外电泳样品进行转膜和封闭后，依次经过 daintain单克隆抗体［8］(1∶1000)、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗(1∶5000)孵育以及化学发光剂显影和定影，鉴定纯化组分。

1.2.2 C反应蛋白和纤维蛋白原检测

将18只昆明鼠随机分为两组，每组9只，其中一组静脉注射溶于生理盐水的daintain，剂量为5 μg/g体重，对照组注射相同体积生理盐水。30 h后对昆明鼠心脏取血，枸橼酸钠抗凝，生化分析仪检测血液中C反应蛋白水平，全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原。

1.2.3 统计分析

2 实验结果和讨论

2.1 实验结果

2.1.1 Daintain纯化鉴定

高效液相色谱分离后的蛋白组分经过 SDSPAGE后，其分子量介于14.4～18.4 kDa之间初步符合daintain(17 kD)的分子量大小(如图1所示，其中1为蛋白分子量标准，2为纯化样品)。

图1 纯化组分的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of purified aliquot

将纯化的蛋白组分与daintain单克隆抗体孵育后，其可与daintain抗体发生特异性结合，说明纯化组分为daintain蛋白(如图2，图中斑点为纯化组分与daintain抗体特异性结合斑点)。

图2 纯化组分的western blot图谱Fig.2 Western blot of purified aliquot

2.1.2 C反应蛋白和纤维蛋白原检测

昆明鼠静脉注射daintain后，其血液中C反应蛋白平均值为2.32±0.47 mg/L，浓度高于对照组C反应蛋白平均值(0.90±0.46 mg/L)，差异显著(P＜0.05)结果见图3。

图3 daintain对血液C反应蛋白水平的影响Fig.3 Assays of C-reactive protein in the blood

而注射daintain后的昆明鼠血浆纤维蛋白原的平均值为1.36±0.15 g/L，显著高于对照组纤维蛋白原平均水平(0.89±0.16 g/L)(P＜0.05)，结果见图4。

图4 daintain对血液纤维蛋白原浓度的影响Fig.4 Assays of fibrinogen in the blood

在检测注射daintain鼠血浆C反应蛋白和纤维蛋白原升高的同时，取血时，在没有抗凝剂存在的情况下，注射daintain组昆明鼠血液粘度增加且血凝时间缩短。

2.2 讨论

C反应蛋白是炎症标志物，具有激活补体和加强吞噬细胞吞噬的作用。在发热性疾病、各种炎症状态和创伤时，血液中C反应蛋白水平会明显增高，C反应蛋白的检测作为炎症和组织损伤的非特异性标志物大量应用于临床［9］。本实验中巨噬细胞因子 daintain促进 C反应蛋白水平升高，说明daintain可直接激起炎症反应的发生。同时也部分解释了其他小组所报道的daintain激活巨噬细胞，对其迁移增生非常必要［6，7］。

纤维蛋白原是除C反应蛋白外另一种急性时相蛋白，是发生炎症反应的另一指标。其主要生理功能是作为凝血因子I直接参与体内凝血过程。研究发现纤维蛋白原含量升高有促进心血管病发生的作用［10］。我们的实验显示daintain激活了纤维蛋白原，也确实观察到daintain增加了血液粘度，促进了血液凝固，暗示了daintain可能会促进心血管疾病的发生。

心血管疾病的病理基础是动脉粥样硬化。由于炎症在动脉粥样硬化病理过程的各个阶段中均发挥着主导作用［11］，因此，包括C反应蛋白和纤维蛋白原在内的重要炎症因子在动脉粥样硬化风险预测及致病机理中作用的研究，获得了广泛关注［12］。本实验中daintain激活了C反应蛋白和纤维蛋白原。因此，daintain可能在动脉粥样硬化发生发展中扮演一定的角色。围绕这一主题，后续研究可从daintain对免疫细胞的激活和泡沫细胞的形成等方面开展。

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5 Utans U，Arceci RJ，Yamashita Y，et al.Cloning and characterization of allograft inflammatory factor-1:a novel macrophage factor identified in rat cardiac allografts with chronic rejection.J Clin Invest，1995(95):2954-2962.

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7 Tian Y，Kelemen SE and Autieri MV.Am inhibition of AIF-1 expression by constitutive siRNA expression reduces macrophage migration，proliferation，and signal transduction initiated by atherogenic stimuli.Am J Physiol Cell Physiol，2006 (290):C1083-C1091.

8 Fu K，Zhao YY，Tang WX，et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against daintain.Hybridoma，2006(25):95-97.

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10 Renata R，Małgorzata K，Beata KW，et al.Fibrinogen--acute phase protein as a marker of immunological process as atherosclerosis.Folia Med Cracov，2005(46):21-32.

11 Russ R.Atherosclerosis-an inflammatory disease.N Engl J Med，1999(340):115-126.

12 Ridker PM，Stampfer MJ，Rifai N.Novel risk factors for systemic atherosclerosis:a comparison of C-reactive protein，fibrinogen，homocysteine lipoprotein(a)，and standard cholesterol screening as predictors of peripheral arterial disease. JAMA，2001(285):2481-2485.

Macrophage Cytokine Daintain Stimulates Inflammatory Reaction in the Blood

ZHAO Yan-ying1，2*，WANG Jun-han3，CHEN Zheng-wang21College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China;2School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology;3Huazhong University of Science and Technology Hospital，Wuhan 430074，China

Daintain is a macrophage inflammatory factor characterized by us.There is an intimate relationship between daintain and inflammation without direct evidence by now.In the present study，we demonstrated that daintain increases the level of C-reactive protein(CRP)and actives fibrinogen in the blood with higher blood viscosity and faster blood coagulation.The results indicated that daintain invokes inflammatory reactions in the blood directly，suggesting that daintain may be involved in cardiovascular disease.

daintain;CRP;fibrinogen;inflammation

1001-6880(2011)03-0425-03

2011-04-07 接受日期:2011-05-11

国家“863”高技术研究发展计划(2002AA214061)，国家自然科学基金项目(30370647、30470823)

*通讯作者 E-mail:biozyy@163.com

R284.2

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