猪布鲁菌S2 omp10基因缺失株的构建及特性

杨艳北,韩文瑜,孙长江

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062)

布鲁菌病是一种全球重要的人畜共患病,布鲁菌是该病的病原菌,革兰阴性细菌,兼性的细胞内寄生菌,可能引起不同种哺乳动物发病,包括人、牛、山羊、绵羊、猪、啮齿类及哺乳类动物。在大部分宿主动物中,该病主要引起生殖系统的损害,导致动物生产性能的下降[1]。布鲁菌病是一种慢性传染性疾病,预防主要是通过接种疫苗来实现的 ,现有的疫苗主要是减毒活疫苗 ,如S2、Rev.1、S19等,这些疫苗具有较好的免疫保护效果,但是仍然存在一定的毒力,可能导致动物发病[2]。1998年 Tibor等[3]对S19和Rev.1敲除编码基因P39,发现在小鼠模型上残余毒力和保护力无影响。2002年Eleonora Campos等[4]对S19以荧光素酶基因替代编码基因Bp26和Bmp18,发现在小鼠模型上毒力减弱,并且可以利用荧光素酶来检测。2011年 Chacon-Diaz等[5]发现绿色荧光蛋白可以做为布鲁菌疫苗的分子标记。减毒活疫苗在血清学检测上很难和自然感染相区分,导致利用疫苗免疫无法根除布鲁菌病。为了克服血清学诊断上的困难,通过现代分子生物学技术对布鲁菌进行分子标记是一种有效的途径。针对减毒活疫苗的这些缺点,本研究拟在减毒活疫苗株的基础上,对菌株进行改造,敲除布鲁菌的重要诊断抗原omp10基因[6-7],使疫苗株的毒力进一步降低,以区分疫苗免疫和自然感染。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞、质粒和载体 猪布鲁菌(brucella suis,S2)购自中国兽医药品监察所,大肠杆菌(Escherichia coli,DH5α),p BluescriptⅡsk(+)质粒为本室保存,p EMOC2质粒由德国Gerlach博士惠赠。

1.2 引物 设计扩增N端同源臂的上下游引物omp10-N-F和omp10-N-R,上下游引物的5′端分别添加 Xba I和 Pst I,扩增 C端同源臂的引物omp10-C-F和omp10-C-R,上下游引物的5′端分别添加Sal I和Xho I,设计扩增sacB基因的上下游引物sacB-F和sacB-R,上下游引物的5′端分别添加Apa I和Kpn I,设计位于omp10基因上的鉴定引物omp10-F和omp10-R,上下游引物的5′端分别添加Eco RI和Xho I。设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。DNA测序结果由北京六和华大基因科技股份有限公司提供。本研究所用的引物及其序列见表1。

表1 引物名称及序列

1.3 主要试剂 DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及细菌基因组提取试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司 ,各种限制性内切酶购自TaKaRa公司 ,T4 DNA连接酶购自NEB公司 ,布氏肉汤培养基购自青岛日水生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.4 实验动物 昆明系小鼠购自吉林大学实验动物中心。

1.5 布鲁菌基因组DNA的提取 S2株布鲁菌接种到液体布氏肉汤培养基上,37℃,5%CO2培养至对数后期,按照细菌基因组提取试剂盒说明书,提取基因组DNA。

1.6 PCR扩增 以基因组DNA为模板,利用引物omp10-N-F和 omp10-N-R进行扩增,反应条件：95℃预变性5 min,95℃变性30 s,61℃退火45 s,72℃延伸1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min,扩增出omp10基因的上游同源臂。以基因组DNA为模板,利用引物 omp10-C-F和omp10-C-R进行扩增,反应条件：95℃预变性5 min,95℃变性30s,62℃退火45 s,72℃延伸1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min,扩增出omp10基因的下游同源臂。以PEMOC2质粒为模板,利用引物sacB-F和sacB-R进行扩增,反应条件：95℃预变性 5 min,95℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min,扩增出sacB基因。

1.7 自杀性质粒的构建 将扩增出omp10基因的上游同源臂PCR产物,用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化,经Xba I和Pst I双酶切后,产物用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化,与用相同酶切后的pBluescriptⅡsk(+)质粒,用T4 DNA连接酶使之连接。用上述相同的方法,将omp10基因的下游同源臂及sacB基因连接到质粒上,构建出自杀质粒 pBluescriptⅡsk(+)-omp10-u-d-sacB。

1.8 布鲁菌S2感受态的制备 取培养至对数中期的100 mL布氏肉汤液体培养物,放冰水中冷却30 min,不时的缓慢摇匀保证内容物充分冷却,12 000 r/min离心10 min,弃去培养基,再用冰冷灭菌的10%甘油水离心洗涤3次,最后将获得的菌体重悬于1 mL 10%甘油水溶液中,即为待用的布鲁菌感受态。

1.9 布鲁菌S2的电转化 取约5μg pBluescriptⅡsk(+)-omp10-u-d-sacB质粒加入到100μL S2感受态中,混匀后转移到电极杯中电击。电击条件：2 500V,100 ms。电击完成后,立即加入1 mL布氏肉汤液体培养基,在 37℃,5%CO2摇振培养12 h后,取200μL菌液涂布到含有筛选标记的布氏肉汤固体培养基上,37℃,5%CO2培养72 h以上,挑选出单菌落,进一步培养鉴定。

1.10 单交换子的筛选 把电转化受体菌涂布在含有Amp 100 mg/L的布氏肉汤固体培养基上,同源重组载体上带有筛选标记基因,可筛选出单交换子。

1.11 双交换子的筛选 将获得的同源重组单交换子在布氏肉汤液体培养基上培养72 h,适当稀释,取200μL涂布于添加5%蔗糖的布氏肉汤固体培养基上,37℃,5%CO2培养72 h。因自杀质粒上含有sacB基因,该基因编码的果糖蔗糖酶,能将蔗糖水解为果糖并生成相对分子质量较大的果聚糖,在布鲁菌周质空间累积,导致细胞停止生长或死亡,挑取单菌落即为阳性同源重组双交换子(丢失sacB基因和抗性基因)。该基因缺失株命名为S2-Δomp10。

1.12 双交换子PCR方法的验证 根据S2-Δomp10中omp10基因缺失的序列 ,设计一对引物,omp10-F和omp10-R,预期扩增大小为321 bp。利用这对引物进行扩增 ,S2-Δomp10菌株扩增为阴性。反应条件：95℃预变性5 min,95℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸30 s,30个循环;最后72℃延伸10 min。

1.13 小鼠感染试验 将6周龄左右的雌性昆明系小鼠 ,随机分组 ,每个时间点每组 8只,用腹腔注射的方式每只注射200μL浓度约为 107CFU/mL布鲁菌 ,在感染后第1、2、3周 ,处死小鼠 ,无菌条件下取小鼠的脾脏 ,放入1 mL生理盐水中匀浆 ,取100μL涂板计数。

2 结果

2.1 自杀性质粒的PCR鉴定及测序 从自杀性质粒p BluescriptⅡsk(+)-omp10-u-d-sacB扩增出omp10基因上游同源臂1 032 bp大小的基因片段,扩增出含有omp10基因下游同源臂975 bp大小的基因片段,见图1。扩增出1 422 bp大小的sacB基因片段,见图2。均可观察到与理论值大小相符条带,DNA测序结果表明,所构建的自杀性质粒中插入的序列是正确的(结果略)。

2.2 布鲁菌S2株omp10基因缺失株的PCR鉴定用 omp10-F和 omp10-R鉴定引物对 S2进行PCR鉴定,扩增出预期大小的321 bp产物,而S2-Δomp10为阴性,初步表明标记株构建是正确的,见图3。对鉴定引物扩增产物进行序列测定,结果与预期一致(结果略),表明标记株的序列是正确的 ,omp10基因被成功敲除。

2.3 基因缺失株在小鼠脾脏内的存活能力 S2-Δomp10与S2感染小鼠后,1～3周小鼠脾脏中的S2-Δomp10与S2细菌数都呈下降状态 。1～2周内小鼠脾脏中的细菌数S2-Δomp10与S2基本一致,到第3周时,小鼠脾脏中的细菌数S2-Δomp10少于S2。与S2相比 ,S2-Δomp10在体内的生存能力有所降低,见图4。

3 讨论

pBluescriptⅡsk(+)质粒在大肠杆菌中可以复制,在布鲁菌中无法复制,该质粒在布鲁菌中为自杀质粒[4],电转化法把自杀性质粒转入S2中,转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀性质粒便会被线性化,自杀性质粒上含有受体菌基因的同源序列,它便会插入受体菌S2的染色体中,接着质粒与omp10基因发生置换,只有置换到S2染色体上的自杀性质粒才能随着染色体的复制而存在,AMP作为负筛选标记,sacB基因作为正筛选标记,成功构建出无抗生素抗性标记的基因缺失株S2-Δomp10,减少因抗性基因可能带来的生物安全的隐患。

从小鼠体内的存活可以看出,1～2周内S2-Δomp10和S2在小鼠脾脏中细菌数是基本一致的,但在感染后的第3周,脾脏中S2-Δomp10的数量少于S2,与S2相比 ,S2-Δomp10的感染力进一步减弱与Anne Tibor[7]结论是一致的。S2-Δomp10在体内的生存能力有所降低,毒力减弱,但是可能会影响免疫持续时间和免疫效果。

omp10作为布鲁菌的一个诊断抗原基因,该蛋白已被用于大肠杆菌表达并纯化[8],Western blot和间接ELISA试验证明 ,纯化之后的omp10重组蛋白可以被布鲁菌阳性血清识别[9],本研究对omp10进行了缺失标记 ,然后比较了其缺失株在小鼠体内的生存能力,结果表明,缺失株在体内的生存能力降低 ,omp10在布鲁菌的毒力,特别是细胞内生存方面,发挥了一定的作用。

本研究利用同源重组的方法 ,成功构建了omp10的基因缺失株 ,为进一步进行免疫保护性评价及基因标记疫苗的应用奠定了基础。

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