甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用效果评价

乔彩霞,高志强,张利峰,蒲 静,谷 强,张 伟,刘来福,刘金华,张鹤晓

(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;2.北京出入境检验检疫局,北京朝阳100026)

甲型 H 1N1流感发生后不久,世界卫生组织(WHO)在其网站上公布了美国疾病预防控制中心(CDC)推荐的荧光RT-PCR引物和探针[1],之后我国农业部、卫生部、国家质检总局和多家企业也相继研制了多种甲型H1N1流感特异性RT-PCR和荧光RT-PCR诊断试剂,并在我国较多实验室中广泛使用,在诊断和防控中发挥了重要作用[2]。但是,因为我国各级实验室条件、技术水平差异较大,加之甲型H1N 1流感诊断试剂的复杂多样,直接影响了结果的可比性和准确性。2010年10月高志强等利用体外转录的方法,研制了甲型 H1N1流感病毒(2009)和经典H 1N1猪流感病毒(SIV)的核酸检测标准物质,为完成检测试剂的标准化建立了基础[3]。为了合理评估各级实验室检测甲型H1N1流感病毒的能力,则需要开展甲型H 1N1流感病毒核酸检测的能力验证,以此衡量CNAS认可或申请认可实验室的检测资质,为实验室的认可评审工作提供依据,同时对现有的检测试剂和方法做出评估,发现可能存在的问题,整体提升我国甲型H 1N1流感的检测水平。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器设备 经典H1N1 SIV和甲型H1N1流感病毒(2009)HA、NA和M 基因片段体外转录标准物质,由本实验室制备和保存;Trizol试剂,购自Invitrogen公司;7900型荧光定量PCR仪,购自ABI公司。

1.2 主要检测方法及引物、探针 应用的检测技术主要包括甲型流感病毒通用 RT-PCR(包括荧光RT-PCR)、猪流感病毒 H 1亚型和N 1亚型通用RT-PCR(包括荧光 RT-PCR)等,所用引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成,详细序列信息和来源见表1。

1.3 能力验证样品的制备 选用Trizol作为基质制备能力验证样品7份,其中A～E组含有梯度稀释的甲型H 1N1流感病毒核酸标准物质(HA、NA和M基因体外转录产物),可分别作为强阳性和弱阳性样品;F组不含有任何流感病毒核酸的阴性样品,G组只含有经典 H 1N1 SIV核酸标准物质(HA、NA和M 基因体外转录产物)。经由1.2中所列方法确定参考CT值。同时将A～C和G组样品应用CDC推荐的普通RT-PCR检测,确保满足验证需要[5]。

表1 样品制备过程中所用检测技术及引物和探针

1.4 能力验证样品的分析

1.4.1 均匀性检验 A～E、G、F组样品,随机各抽取10份,以 M基因作为指标代表,按照GB/T 19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》检测,分析均匀性。

1.4.2 稳定性检验 选用D、E组和G组样品,在模拟运输条件储存10 d后,选择M基因作为指标进行检测,结果进行统计学分析。

1.5 能力验证的组织形式 北京出入境检验检疫局技术中心统一提供上述7组样品供参试实验室检测,对检测试剂和方法不作指定,检测完毕结果报验证单位审核评价。

1.6 参试实验室及选择方法 共有23个省市的54家单位报名参加了本次能力验证,其中出入境行业31个、卫生部门CDC15家、地方兽医防疫监管单位7家、其他1家。其中50个实验室报送了有效结果,06、07、09号和42号未报送结果。所选择的检测方法有3种：方法1,普通RT-PCR作为参试方法,分为甲型流感病毒通用检测技术和甲型H 1N1流感病毒(2009)特异性检测技术;方法2,甲型流感病毒通用荧光 RT-PCR检测技术;方法 3,甲型H1N1流感病毒(2009)特异性荧光 RT-PCR检测技术。详见表2。

1.7 验证结果评价 如全部检测结果与样品背景相符判定为满意;如出现任何误判(假阴性、假阳性或甲型H1N1流感病毒(2009)误判),判定为不满意;如采用普通RT-PCR作为参试方法,不能区分甲型H 1N1流感病毒但可实现经典H1N1 SIV检测的判定为猪流感RT-PCR满意。

表2 参试实验室方法选择汇总

2 结果

2.1 验证样品的制备 7组能力验证样品包含有不同浓度的甲型H1N1流感病毒核酸样品、经典H1N1 SIV核酸样品和阴性样品,基本情况如表3所示。

2.2 均匀性检测 经美国CDC推荐的甲型流感病毒通用荧光RT-PCR检测,将Ct值进行单因子方差分析。按临界值F0.05(9,10)=3.23分析,各组样品的F值介于0.5～1.04之间,均小于F临界值,表明样品中核酸含量均匀。同时,样品间变异系数C.V.介于1.2%～2.2%,均小于5%,表明样品间变异不显著。F组样品经检测均为阴性。

表3 能力验证样品的基本情况

2.3 稳定性检测 对4℃冷藏保存10 d的样品进行荧光RT-PCR检测,将获得的Ct值与对照组(0 d样品)进行差异显著性检验-t检验分析,D、E和G组的t值分别为0.35、0.97和0.62,差异无统计学意义(P＞0.05),表明该样品在冷藏保存过程中具有良好的稳定性。

2.4 能力验证结果 能力验证评价结果：34家实验室能力验证结果评价为满意,可对甲型H 1N1流感病毒(2009)做出特异性检测,整体满意率为68%。不满意的实验室共16家,详细见表4,其中08、26和52报送了错误结果。有8家实验室选择方法1,可检测经典H1N1 SIV,但未能特异性检出甲型 H 1N1 流感病毒(2009),分别为 8、10、12、13、27、35、41、54 。

表4 参试实验室报告甲型H1N1流感病毒(2009)不满意结果情况汇总

3 讨论

对甲型H1N1流感病毒的遗传分析表明,其属于猪源流感病毒(S-OIV)的变异株,其HA基因片段与北美SIV同源性最高,达95%左右,NA和M基因片段则与欧亚猪源流感病毒最为相近,同源性分别为92%和97%[6]。为检测甲型H1N1流感病毒,需要实现甲型H 1N1流感病毒与人H1N1亚型季节性流感病毒以及经典H 1N1 SIV的鉴别诊断。甲型H1N1流感发生后,国内外出现了多种特异性的核酸检测技术,但鉴于检测试剂的复杂多样,检测单位条件的千差万别,有必要对承担检测任务的实验室进行能力验证考核。

本试验利用甲型H 1N1流感病毒和经典H 1N 1 SIV核酸检测标准物质制备能力验证样品,组织实施了CNAS T0459甲型H 1N1流感病毒核酸检测能力验证计划。普通RT-PCR和荧光RT-PCR技术是应用于甲型H1N1流感病毒核酸检测的主要方法,也是本次能力验证考核的技术指标。在能力验证样品的制备上,我们兼顾了两种不同方法的敏感性,设计了7组样品,均匀性和稳定性试验表明,达到了中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求[7]。同时,该样品无生物传染性,确保了能力验证实施过程的生物安全。

在对50家参试实验室报告的有效数据分析后表明,34家实验室获得满意结果,满意率达68%。其余16家实验室结果不满意。其中部分实验室由于选择方法和试剂不当,导致不满意结果,检测中仅注重对人的季节性流感病毒H 1N1亚型和甲型H1N1流感病毒(2009)区分,但却忽视了甲型H 1N1流感病毒(2009)与经典H 1N1亚型SIV的鉴别诊断。由于这两种病毒在多个基因上存在高度的同源性,如果用于检测甲型H 1N1流感病毒的试剂特异性不强,在对经典H1N1 SIV检测中就会呈现非特异性的扩增反应。分析此次能力验证的结果,建议需要改进的方面有：(1)强化各实验室检测能力的培训,定期进行考核,确保检测的质量,避免出现假阳性、假阴性结果。(2)完善甲型H 1N1流感病毒检测方法标准的制定,使各级实验室在检测时有据可依。(3)急需进行甲型H 1N1流感病毒检测试剂的标准化研制,督促商品化检测试剂评价体系的建立。

总之,此次能力验证,不仅为甲型 H1N1流感的诊断和防控能力的评估提供了有力的数据,同时也为实验室能力验证积累了宝贵的经验。

[1] World Health Organization.CDCprotocol of realtime RT-PCR for swine influenza A(H 1N1)[EB/OL].http：//www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/CDCrealtimeRTPCR-protocol_20090428.pdf,2009-4-28.

[2] 潘朝思,罗宝正,薄清如,等.多重实时 RT-PCR快速检测新型甲型H1N1流感病毒[J].农业生物技术学报,2010,18(2)：352-355.

[3] 高志强,张鹤晓,乔彩霞,等.2009年大流行H 1N1流感病毒与经典H1N1猪流感病毒核酸扩增检测标准物质研究[J].计量学报,2010,31(z1)：4-9.

[4] 杨焕良,乔传玲,陈艳,等.猪流感病毒H 1N1、H 1N2和H 3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立[J].中国预防兽医学报,2007,29(9)：714-717.

[5] 卫生部.甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/2565527.htm,2009-6-28.

[6] Peiris J S,Poon L L,Guan Y.Emergenceof a Novel Swine-Origin Influenza A(H1N1)Virusin Humans[J].Journal of Clinical Virology,2009,45：169-173.

[7] 中国合格评定国家认可委员会.能力验证样品均匀性和稳定性评价指南[EB/OL].http：//www.cnas.org.cn/extra/col23/1153814696.pdf CNAS-GL03：1-7,2006-6.