胰腺癌内皮分化基因受体表达

龚涌灵 王卫东 王少开 陶晨洁 杨劲松 田韧 陈锦飞 王书奎 吕广梅

·论著·

胰腺癌内皮分化基因受体表达

龚涌灵 王卫东 王少开 陶晨洁 杨劲松 田韧 陈锦飞 王书奎 吕广梅

目的观察胰腺癌组织溶血磷脂酸(LPA)内皮分化基因受体(Edg/LPA)的表达，探讨其临床意义。方法收集50例胰腺癌及对应癌旁正常胰腺组织标本，采用实时定量PCR、免疫组化和蛋白质印迹法检测3种Edg/LPA受体亚型Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3受体mRNA及蛋白的表达，分析其与胰腺癌临床病理参数的关系。结果胰腺癌组织Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受体mRNA表达量分别为(0.142±0.042)%、(0.471±0.064)%、(0.231±0.043)%，对应癌旁正常胰腺组织分别为(0.132±0.029)%、(0.027±0.015)%、(0.163±0.046)%，其中胰腺癌组织的Edg-4/LPA2受体mRNA表达较对应癌旁组织显著增加(P<0.05)。同样，胰腺癌组织Edg-4/LPA2蛋白表达也显著高于癌旁正常胰腺组织。胰腺癌组织的3种Edg/LPA受体mRNA表达水平与血清CA19-9浓度呈平行关系，差异无统计学意义。胰腺癌组织Edg-4/LPA2受体mRNA表达与肿瘤大小、导管腺癌的分化程度及侵袭转移有关，而Edg-2/LPA1、Edg-7/LPA3受体mRNA表达仅与肿瘤的侵袭转移有关。结论胰腺癌组织高表达Edg-4/LPA2受体，其高表达反映出肿瘤的恶性生物学行为。

胰腺肿瘤； 溶血磷脂酸； Edg/LPA受体

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一种对多种细胞具有不同生物学活性作用的磷脂介质，在组织中广泛存在。它已被证明能够调节肿瘤细胞的生长和侵袭[1]。LPA在人胰腺导管腺癌可诱导产生包括细胞增殖、迁徙等生物学效应[2]。LPA通过细胞表面的一类G蛋白耦联的七螺旋受体亚族作用于靶细胞,该受体又名为内皮分化基因(endothelial differentiation gene，Edg)或溶血磷脂 (lysophospholipid)受体亚族。常见的Edg/LPA有Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3。近年来，LPA受体在恶性肿瘤发生、发展中的作用成为研究的热点。本研究检测胰腺癌组织LPA基因受体表达的变化，分析其与胰腺癌临床病理参数的关系，探讨其诊断和治疗胰腺癌的临床价值。

材料和方法

一、临床资料

收集南京医科大学附属南京第一医院和深圳市第二人民医院2006年6月至2010年10月诊治的胰腺癌患者50例，其中男性34例，女性16例，年龄32～64岁,中位年龄52岁。导管腺癌39例,腺泡细胞癌4例,其他类型7例；肿瘤位于胰头32例，胰体、尾癌14例，全胰腺4例；Ⅰ期 2例, Ⅱ期 6例,Ⅲ期 27例, Ⅳ期15例。另收集对应胰腺癌旁正常组织作为对照。

二、方法

1．Edg-2/LPA1、Edg-4/ LPA2、Edg-7/LPA3受体mRNA检测：采用实时定量PCR法检测。引物应用Primer premier 5软件设计。Edg-2/LPA1正义引物：5′-GCTGCCATCTCTACTTCCATC-3′，反义引物5′-AAGCGGCGGTTGACATAGATT-3′，扩增片段236 bp；Edg-4/LPA2正义引物5′-GCTCAACCCAACCAAC-3′，反义引物5′-TTATCTCTCCCCACCTTA-3′，扩增片段289 bp；Edg-7/LPA3正义引物5′-GCTTGTGAT-TGTTTTGTGTG-3′，反义引物5′-TGGTCAGGTTGCTATGGA-3′，扩增片段338 bp；内参GAPDH正义引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，反义引物5′-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3′，扩增片段352 bp。引物由金思特科技(南京)有限公司合成。由PCR仪自带软件获取目的基因及GAPDH的Δt值，以目的基因表达量除以其管家基因GAPDH表达量表示该基因校正后的相对表达量。依据美国ABI实时荧光定量PCR仪7500的protocl计算公式为：1/2Δt×100%。每个样本重复3次，取平均值。

2．Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3蛋白检测：分别采用常规免疫组化染色和蛋白质印迹法检测。兔抗人LPA1、LPA2、LPA3抗体及通用型山羊抗兔IgG抗体-Fab段-HRP多聚体均购自北京博奥森生物技术有限公司(货号：bs-2880R、bs-2881R、bs-2882R、KGAA57)。免疫组化最后DAB显色，苏木精复染。用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。胞质中出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。蛋白质印迹法最后ECL发光，X线胶片曝光、显影。

三、统计学处理

结 果

一、Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受体mRNA的表达

胰腺癌组织Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受体mRNA表达量分别为(0.142±0.042)%、(0.471±0.064)%、(0.231±0.043)%，对应癌旁正常胰腺组织分别为(0.132±0.029)%、(0.027±0.015)%、(0.163 ±0.046)%，胰腺癌组织的Edg-4/LPA2受体mRNA表达较对应癌旁组织显著增加(P<0.05；图1、2)。

图1胰腺癌及癌旁组织Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受体mRNA表达

图2Edg-2/LPA1(a)、Edg-4/LPA2(b)、Edg-7/LPA3(c)受体mRNA检测曲线和标准线性均值(d)

二、Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受体蛋白的表达

免疫组化显示Edg-4/ LPA2蛋白表达于癌细胞的胞质和胞膜，癌组织Edg-4/LPA2蛋白表达较癌旁正常明显增加(图3)。

图3胰腺癌(a)与癌旁胰腺组织(b)Edg-4/LPA2蛋白表达(免疫组化 ×400)

蛋白质印迹法显示胰腺癌组织Edg-4/LPA2蛋白表达较癌旁组织明显增强；而Edg-2/LPA1及Edg-7/LPA3蛋白的表达与癌旁组织无明显差别(图4)。

图4胰腺癌组织(T)和癌旁组织(C)Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3蛋白的表达

三、胰腺癌Edg/LPA受体mRNA表达与临床病理参数的关系

胰腺癌组织3种Edg/LPA受体mRNA表达水平与血清CA19-9浓度呈平行关系，但无显著差异。

胰腺癌组织Edg-4/LPA2受体mRNA表达与肿瘤大小、导管腺癌的分化程度有关，而Edg-2/LPA1、Edg-7/LPA3受体mRNA表达与它们无关。3种Edg/LPA受体mRNA表达均与肿瘤的浸润、转移有关，其中Edg-4/LPA2受体mRNA表达与肿瘤的浸润、转移相关性最为显著(表1)。

表1 胰腺癌组织Edg/LPA受体mRNA表达水平与肿瘤临床病理参数的相关性

注：aP<0.05

讨 论

LPA是膜来源的脂质小分子、结构最简单的甘油磷酸酯，其甘油骨架上C-3为磷酸基团、C-2为羟基，从而使LPA具有亲水性，合成后被释放到细胞外起到信号分子的作用；Sn位点通过化学键与不同长度的长链脂肪酸结合产生生物活性，具有亲脂性[3]。除血小板外，某些炎症细胞、神经细胞、损伤细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等受到刺激后均可通过自分泌、旁分泌的形式释放LPA,产生不同的生物学效应[4]。

LPA的受体亚型主要有Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3。文献报道，某些类型的肿瘤细胞,虽然Edg/LPA受体各亚型都能促进细胞迁移，其中最基本的、最重要的受体亚型是Edg-2/LPA1基因受体。敲除Edg-2/LPA1受体或用Ki16425等药物抑制Edg-2/LPA1受体，可持续阻断LPA所致的肿瘤细胞的趋化反应[5]。下调Edg-2/LPA1受体的表达或活性，能抑制乳腺癌荷瘤裸鼠的骨转移。Edg-2/LPA1相较于其他类型的Edg/LPA受体亚型有着更广泛的组织分布。

不同于Edg-2/ LPA1受体,Edg-4/LPA2受体似乎并不是LPA引起细胞迁移效应的主要载体。然而有力的证据表明,恶性肿瘤 Edg-4/LPA2受体的表达通常是增强的。卵巢癌细胞Edg-4/LPA2受体和(或)Edg-7/LPA3受体mRNAs表达显著高于正常卵巢上皮细胞。30%的卵巢癌高表达Edg-4/LPA2受体，45%的卵巢癌高表达Edg-7/LPA3受体，或两者兼而高表达[6]。分化型甲状腺癌高表达Edg-4/LPA2受体mRNA[7]。57%的浸润性导管乳腺癌高表达Edg-4/LPA2受体，且更常见于绝经后乳腺癌患者(67%)[8]。胃癌也高表达Edg-4/LPA2受体，其中肠型(67%)胃癌的高表达较浸润扩散型(32%)胃癌更常见，且与淋巴、静脉浸润,淋巴结转移和肿瘤进展相关[9]。结肠、直肠癌Edg-4/LPA2受体mRNA表达较正常肠黏膜显著增加,而Edg-2/LPA1表达相对低下。

Edg-7/LPA3受体较少在正常组织表达，也仅见卵巢癌组织和卵巢癌细胞株高表达Edg-7/LPA3受体的报道,在其他类型的恶性肿瘤均未见Edg-7/LPA3受体异常表达。另有报道，Edg-7/LPA3受体缺失可提高Edg-2/LPA1受体介导的肿瘤细胞迁移[10]。

本结果显示，胰腺癌组织Edg-4/LPA2受体mRNA及蛋白的表达显著高于癌旁正常胰腺组织，而Edg-2/LPA1和Edg-7/LPA3受体mRNA的表达与癌旁组织无显著差异(P<0.05)，提示Edg-4/LPA2受体的异常表达参与胰腺癌的发生、发展。进一步的分析提示，胰腺癌Edg-4/LPA2受体表达与血清CA19-9同步升高，有可能联合CA19-9检测可为临床胰腺癌的诊断提供帮助。此外，Edg-4/LPA2受体表达与肿瘤大小、分化程度、及浸润转移相关，表明Edg-4/LPA2受体高表达与肿瘤的恶性生物学行为有关。

[志谢：特别感谢美国弗吉尼亚州立大学(Virginia Commonwealth University,VCU)医学院的Frank Fang教授，在我们赴美访问期间提供的帮助和指导，以及相关实验材料的惠赠。]

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2011-05-26)

(本文编辑：屠振兴)

Expressionofendothelialdifferemtiationgenereceptorsinhumanpancreaticcancer

GONGYong-ling,WANGWei-dong,WANGShao-kai,TaoChen-jie,YANGJing-song,TIANRen,CHENJing-fei,WANGShu-kui,LÜGuang-mei.

DepartmentofOncologyandCentralLab,Nanjing1stHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China

LÜGuang-mei,Email:lvguangmei@yahoo.com.cn

ObjectiveTo evaluate the expression of endothelial differentiation gene /lysophosphatidic acid (LPA) receptors (Edg/LPA) and its clinical significance in human pancreatic cancer.MethodsFifty cases of pancreatic cancer and adjacent normal tissues were collected, and Real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry was used to determine the expression of Edg-2/LPA1, Edg-4/LPA2 and Edg-7/LPA3 receptors mRNA and protein, and its relationship with clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe expressions of Edg-2/LPA1, Edg-4/LPA2, Edg-7/LPA3 receptor mRNA were (0.142±0.042)%, (0.471±0.064)%, (0.231±0.043)% in pancreatic cancer, and the corresponding values were (0.132±0.029)%, (0.027±0.015)%, (0.163±0.046)% in adjacent normal tissues. The expressions of Edg-4/LPA2 receptor mRNA in pancreatic cancer were significantly lower than that in adjacent normal tissues (P<0.05). The expressions of Edg-4/LPA2 receptor protein in pancreatic cancer were significantly lower than that in adjacent normal tissues (P<0.05). The expressions of three types of Edg /LPA receptor mRNA in pancreatic cancer were parallel to serum CA19-9 levels. The expressions of Edg-4/LPA2 receptor mRNA were associated with tumor size, differentiation degree, and invasive ability and metastasis. While the expressions of Edg-2/LPA1, Edg-7/LPA3 receptor mRNA was associated with invasive ability and metastasis only.ConclusionsEdg-4/LPA2 receptor is highly expressed in pancreatic cancer, which suggesting the malignant biological behavior of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Lysophosphatidic acid; Edg/LPA receptor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.005

南京市医学重点科技发展项目(ZKX09007)；江苏省卫生国际交流支撑计划；江苏省卫生厅科教兴卫工程医学领军人才与创新团队专项基金(苏卫科教2011字第15号)

210006 南京，南京医科大学附属南京第一医院肿瘤科、中心实验室(龚涌灵、王少开、陶晨洁、杨劲松、田韧、陈锦飞、王书奎)；深圳第二人民医院急诊科(王卫东)；江苏建康技术学院医护系(吕广梅)

吕广梅，Email:lvguangmei@yahoo.com.cn，王书奎，Email:shukwang@163.com