TMPRSS4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

李东哲 赵梅芬 宋少伟 许元鸿 郭克建

·论著·

TMPRSS4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

李东哲 赵梅芬 宋少伟 许元鸿 郭克建

目的检测Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用实时PCR法和蛋白质印迹法检测16例胰腺癌和配对癌旁组织TMPRSS4 mRNA和蛋白表达；采用免疫组织化学法检测61例胰腺癌标本、26例配对癌旁组织、4例正常胰腺组织TMPRSS4蛋白的表达，分析其与临床病理特征的相关性。结果胰腺癌组织TMPRSS4 mRNA和蛋白表达明显高于配对癌旁组织(9.09±7.01比1.27±0.72；1.223±0.125比0.667±0.106，P值均<0.01)，胰腺癌组织TMPRSS4蛋白阳性表达率为67.2%(41/61)，显著高于癌旁组织3.8%(1/26)的阳性表达率(P<0.01)。正常胰腺组织未见TMPRSS4蛋白表达。胰腺癌TMPRSS4表达与患者年龄、性别及肿瘤部位、肿瘤大小无关,而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期密切相关(P值均<0.05)。结论胰腺癌组织高表达TMPRSS4，其表达与肿瘤的恶性程度相关。

胰腺肿瘤； 免疫组织化学； TMPRSS4

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(type Ⅱ transmem-brane serlne proteases，TMPRSS4)是Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族(TTSPs)中的新成员。有研究提示，TMPRSS4通过促进上皮细胞向间质细胞的转变(epithelial-to-mesenchymal transitions, EMT)引起肿瘤细胞的浸润、迁移和转移[1]。本实验检测胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中TMPRSS4 mRNA和蛋白的表达，探讨其与临床病理特征的关系。

材料与方法

一、一般资料

61例胰腺癌标本取自中国医科大学附属第一医院2005年1月至2009年10月手术切除并经病理证实的胰腺导管腺癌标本，其中男39例，女22例；年龄39～74岁，平均58岁；术前未行放疗及化疗。取26例配对胰腺癌旁组织及4例正常胰腺组织(胰腺良性肿瘤手术时取的正常胰腺组织)作为对照。另取16例手术切除的新鲜胰腺癌及配对癌旁组织标本，立即置液氮罐中备用。

二、TMPRSS4 mRNA检测

取冻存的16例胰腺癌及配对癌旁组织各约100 mg，研磨成粉末状，应用一步法RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)抽提组织总RNA，分光光度法测定其纯度与浓度。应用逆转录试剂盒(TaKaRa公司)逆转录成cDNA。实时定量PCR法检测TMPRSS4 mRNA。TMPRSS4引物序列：上游5′-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3′,下游5′-GAGAAAGTGAGTGGGAACTG-3′，扩增长度157 bp；内参照β-actin引物序列：上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，扩增长度186 bp。引物由上海生工公司合成。PCR反应条件： 95℃ 30 s，94℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，共40个循环。胰腺癌或相应癌旁组织△Ct值与4例正常胰腺的△Ct均值相比得出△△Ct，TMPRSS4 mRNA表达的RQ值=2-△△Ct。

三、TMPRSS4蛋白检测

1．蛋白质印迹法：用全细胞裂解液提取冻存组织的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，常规行蛋白质印迹法。TMPRSS4多抗(Protein Tech公司)工作浓度1∶1000，GAPDH工作浓度1∶400，最后ECL发光。采用凝胶成像系统扫描，TMPRSS4与GAPDH条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

2．免疫组织化学染色法：61例固定标本切片后采用SP法进行免疫组化染色。TMPRSS4多抗(Protein Tech公司)工作浓度1∶50。PBS替代一抗作为阴性对照。TMPRSS4定位于细胞膜。镜下计算阳性细胞的百分率及观察染色强度。阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；淡黄色为1分，黄色2分，棕或褐黄色为3分。两者相加，≥4分为阳性，≤3分为阴性。

四、统计学处理

结 果

一、TMPRSS4 mRNA和蛋白表达

16例胰腺癌和癌旁组织TMPRSS4 mRNA相对表达量分别为9.09±7.01和1.27±0.72；TMPRSS4蛋白表达量分别为1.223±0.125和0.667±0.106(图1)。胰腺癌组织TMPRSS4 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P值均<0.01)。

N：癌旁组织，T：癌组织；#1～#4为不同配对标本编号

61例胰腺癌组织行免疫组化染色，41例(67.2%)阳性表达，其中7例Ⅲ期胰腺癌中6例阳性表达，且染色强度均呈褐黄色；26例癌旁组织中1例(3.8%)阳性表达；4例正常胰腺组织均未见TMPRSS4的表达(图2)。

图2胰腺癌旁组织(a)及癌组织(b)TMPRSS4表达(免疫组化 ×200)

二、TMPRSS4蛋白表达与临床病理特征的关系

胰腺癌组织TMPRSS4蛋白阳性表达与患者的年龄、性别及肿瘤位置、肿瘤大小均无关(P>0.05)，而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(表1)。

表1胰腺癌组织TMPRSS4表达与肿瘤临床病理特征的关系

临床病理特征例数阳性表达(41例)阴性表达(20例)P值年龄(岁，x±s)58．2±9．357．7±9．90．846性别[例，率(%)] 男3925(64．1)14(35．9)0．491 女2216(72．7)6(27．3)肿瘤部位[例，率(%)] 胰头部4934(69．4)15(30．6)0．465 体尾部127(58．3)5(41．7)分化程度[例，率(%)] 高分化2110(47．6)11(52．4)0．013 中、低分化4031(77．5)9(22．5)肿瘤大小[例，率(%)] >3．5cm2419(79．2)5(20．8)0．109 ≤3．5cm3722(59．5)15(40．5)淋巴结转移[例，率(%)] N04124(58．6)17(41．4)0．039 N12017(85．0)3(15．0)TNM分期[例，率(%)] Ⅰ2511(44．0)14(56．0)0．006 Ⅱ2924(82．8)5(17．2) Ⅲ76(85．7)1(14．3)

讨 论

肿瘤细胞表面的蛋白酶可以降解基底膜和细胞外基质，使恶性肿瘤细胞向周围相邻组织浸润，这是肿瘤转移的多阶段进程中非常重要的事件[2-3]。丝氨酸蛋白酶是最为古老和最为庞大的蛋白酶家族之一。新近发现一类特殊蛋白酶——具有单跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶，被称为Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)[4]。因TTSPs位于细胞的表面，故可以在细胞内与细胞外基质的信号转导中起调控作用。TMPRSS4是由Wallrapp等在2000年从胰腺癌组织中分离出的一个新的TTSP[5]。TMPRSS4过表达的肿瘤细胞形态会出现改变，如细胞膜的边缘波动和板状伪足的形成。目前已经证实，上皮细胞向间充质细胞的转变(EMT)可促进肿瘤细胞的浸润、迁移和转移[6]。在结肠癌细胞中，TMPRSS4正是通过诱导产生EMT促进肿瘤细胞的浸润、迁移和转移[1]。TMPRSS4调控的下游信号通路有FAK、ERK、Akt、Src和Rac1。其中FAK信号通路和ERK的活性是TMPRSS4诱导的浸润和EMT的必要条件[7]。

Wallrapp等[5]报道，TMPRSS4 mRNA在胰腺癌中高表达，而正常胰腺及慢性胰腺炎组织中无TMPRSS4 mRNA的表达。本实验结果与其一致。姚晓峰等[8]报道，甲状腺癌TMPRSS4 mRNA的表达水平与患者性别、年龄及肿瘤大小、不同病理类型无关，而与淋巴结转移和不同临床分期相关(P<0.01)。Kim等[7]报道，结肠癌组织TMPRSS4 mRNA表达较癌旁正常黏膜组织明显增高，且TMPRSS4表达的增高与肿瘤的不同分期相关。本实验结果显示，胰腺癌组织TMPRSS4 mRNA及蛋白的表达显著高于癌旁组织，胰腺癌TMPRSS4的蛋白表达与患者的年龄、性别及肿瘤大小、病理类型无关，而与淋巴转移或远处转移、肿瘤分期相关，而且7例Ⅲ期胰腺癌中有6例呈强阳性表达，提示TMPRSS4可能在胰腺非浸润性肿瘤转变为浸润性肿瘤中起着一定作用。本组胰腺癌TMPRSS4阳性表达率为67.2%，而癌旁组织表达仅为3.8%，提示检测胰腺组织TMPRSS4表达对于胰腺癌的诊断可能有一定的帮助。

[1] Jung H,Lee KP,Park SJ,et al.TMPRSS4 promotes invasion,migration and metastasis of human tumorcells by facilitating an epithelial-mesenchymal transition.Oncogene,2008,27:2635-2647.

[2] Stetler-Stevenson WG, Yu AE. Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Semin Cancer Biol, 2001,11:143-152.

[3] Deryugina EI,Quigley JP. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis.Cancer Metastasis Rev,2006,25:9-34.

[4] Hooper JD,Clements JA,Quigley JP,et al.Type II transmembrane serine proteases.Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes.J Biol Chem,2001,276:857-860.

[5] Wallrapp C, Hahnel S, Muller-Pillasch F,et al. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3) overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Res, 2000,60:2602-2606.

[6] Christiansen JJ,Rajasekaran AK.Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res,2006,66:8319-8326.

[7] Kim S, Kang HY, Nam EH,et al. TMPRSS4 induces invasion and epithelial-mesenchymal transition through upregulation of integrin 5 and its sinaling pathways. Carcinogenesis, 2010，31:597-606.

[8] 姚晓峰，张仑,郑红,等.跨膜丝氨酸蛋白酶4和癌胚纤维连接蛋白在甲状腺癌中的表达.中华实验外科杂志，2008,25:263-263.

2010-11-23)

(本文编辑：屠振兴)

ExpressionofTMPRSS4inpancreaticcancerandclinicalsignificance

LIDong-zhe,ZHAOMei-fen,SONGShao-wei,XUYuan-honng,GUOKe-jian.

DepartmentofPancreaticSurgery,FirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

GUOKe-jian,Email:mfb790726@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of TMPRSS4 mRNA, protein in human pancreatic cancer tissues and to explore the relationship between the expression of TMPRSS4 protein and the clinicopathologic parameters.MethodsReal-time PCR and Western blotting were used to detect the expressions of TMPRSS4 mRNA and protein in 16 samples of pancreatic cancer tissues and adjacent normal pancreatic tissues. The expression of TMPRSS4 protein in 61 samples of pancreatic cancer tissues and 26 samples of adjacent pancreatic tissues and 4 samples of normal pancreatic tissues was detected by using immunohistochemistry and its relationship with clinicopathological features was analyzed.ResultsThe expression of TMPRSS4 mRNA and protein of pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in adjacent pancreatic tissues (9.09±7.01vs. 1.27±0.72; 1.223±0.125vs. 0.667±0.106,P<0.01); the expression rate of TMPRSS4 protein of pancreatic cancer tissues was 67.2%(41/61), which were significantly higher than that in adjacent pancreatic tissues [3.8%(1/26),P<0.01]. There was no TMPRSS4 protein expression in normal pancreatic tissues. There was no significant correlation between the expression of TMPRSS4 protein and the age, gender, tumor location or tumor size was found. There was significant correlation between the expression of TMPRSS4 protein and the degree of differentiation, lymph node metastasis, and clinical staging (P<0.05).ConclusionsTMPRSS4 protein is highly expressed in pancreatic cancer tissues, and the expression of TMPRSS4 is associated with the degree of malignancy of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Immunohistochemistry; TMPRSS4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.003

110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院胰腺外科

郭克建，Email: mfb790726@163.com