Hedgehog信号通路相关蛋白在大鼠胰腺癌发生过程中的变化

夏伟 王洛伟 蒋斐 黄玲 李兆申

·论著·

Hedgehog信号通路相关蛋白在大鼠胰腺癌发生过程中的变化

夏伟 王洛伟 蒋斐 黄玲 李兆申

目的观察Hedgehog信号通路相关蛋白Ptch、Smo和Gli1在胰腺癌发生过程中的作用。方法200只SD大鼠分成对照组(20只)、二甲基苯并蒽(DMBA)组(90只)和环巴明治疗组(90只)。通过胰腺被膜下直接置入DMBA方法诱导胰腺癌模型。环巴明组在置入DMBA后每天腹腔注射6.25 ml/kg体重环巴明溶液。4个月后处死大鼠，观察胰腺组织病理学改变，应用免疫组化SP法检测胰腺癌及正常胰腺组织中Ptch、Smo、Gli1的蛋白表达。结果DMBA组胰腺癌诱发成功率为57.5%(46/80),诱发的肿瘤最大径为 0.5～>2.0 cm；环巴明组诱发成功率为17.1%(14/82),肿瘤最大径为0.5～2.0 cm。两组胰腺癌发生率及肿瘤大小的差异具有统计学意义(P值均<0.05)。DMBA组胰腺癌组织中Ptch、Smo及Gli1阳性表达率分别为82.6%、73.9%和65.2%；环巴明组分别为50.0%、42.9%和28.6%，两组差异具有统计学意义(P值均<0.05)。3组的正常胰腺组织中均无Ptch、Smo、Gli1阳性表达。结论较大剂量DMBA置入胰实质内可在短期内获得较高的胰腺癌发生率；胰腺癌组织Hedgehog信号蛋白表达显著增加；环巴明能抑制Hedgehog信号蛋白表达，进而抑制胰腺癌发生和发展。

胰腺肿瘤； Hedgehog信号通路； 环巴明； 免疫组织化学

Hedgehog信号通路是调节人类胚胎发育过程的经典通路之一，主要由膜受体Ptch、Smo和核转录因子Gli1等组成。Hedgehog信号通路与某些恶性肿瘤的发生、发展有关[1-2]。Hedgehog通路阻断剂环巴明(Cyclopamine)是一种异甾体类生物碱，能特异性抑制Smo活性，从而抑制Hedgehog信号通路，发挥抗肿瘤作用[3]。本研究应用环巴明干预由二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的胰腺癌大鼠，观察Hedgehog信号通路相关蛋白在胰腺癌发生过程中的变化。

材料与方法

一、动物模型的建立及分组

200只SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供,体重190～210 g,雌雄不限,分成对照组(20只)、DMBA组(90只)和环巴明组(90只)。DMBA组和环巴明组大鼠麻醉后经上腹正中切口进腹,暴露胰腺,于体尾部切开胰腺被膜及部分实质,深1 mm,置入9 mg DMBA(Sigma公司)，缝合胰腺被膜后关腹。将环巴明溶解于二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度4 mg/ml的溶液，环巴明组大鼠术后每天腹腔注射6.25 ml/kg体重环巴明溶液。对照组大鼠仅开腹、关腹，不置DMBA。术后4个月处死大鼠。

二、大体及病理组织学观察

大鼠处死后剖腹观察胰腺手术部位与周围组织粘连状况，胰腺DMBA植入处的形态、质地，胰腺及全身主要脏器的肉眼改变。取胰腺及部分肝、胆囊、胆总管、胃、肠、肺和脑组织，常规行病理学检查。

三、Ptch、Smo、Gli1蛋白检测

采用免疫组化SP法检测，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按说明书操作。山羊抗鼠Ptch、Gli1多抗购自Santacruz公司；兔抗鼠Smo多抗购自Abcam公司。Smo和Ptch工作浓度为1∶400，Gli1工作浓度为1∶500。用已知阳性的前列腺癌组织作为阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照。由两名病理科医师双盲法读片。胞膜、胞质或胞核出现黄色或棕褐色颗粒为阳性。每张切片选取5个高倍视野,计数1000个细胞。无阳性细胞为0分,阳性细胞<25%为1分,25%～75%为2分,>75%为3分；不显色或显色不清为0分,黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两分值相加，1分以上为阳性[4]。

四、统计学方法

应用SPSS 10. 0统计软件包处理数据，采用t检验、χ2检验、秩和检验或Fisher′s精确概率法分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、建模情况

DMBA组和环巴明组分别有10只和8只大鼠死亡。存活的大鼠，在胰腺DMBA植入部位均见大小不等的球形包块,切开包块可见少数残留的黄色DMBA颗粒，包块壁胰腺组织质地较硬，胰腺与胃、肠管等周围器官粘连明显。46只(57.5%)DMBA组大鼠发生胰腺导管癌 (图1a)，其中24只肿块最大径为0.5～1.0 cm，16只为1.0～2.0 cm，6只>2.0 cm。14只(17.1%)环巴明组大鼠发生胰腺导管癌 (图1b)，其中11只肿块最大径为0.5～1.0 cm,3只为1.0～2.0 cm。两组胰腺癌发生率及肿瘤大小的差异具有统计学意义(P值均<0.05)。对照组未见明显包块和组织黏连，胰腺组织无明显病理变化。3组的胰腺外主要脏器(包括肝、胆囊、胆总管、胃、肠、肺等) 均无肿瘤发生及病理组织学改变 。

图1DMBA组(a)和环巴明组(b)组大鼠胰腺病理改变(HE ×200)

二、胰腺癌组织Ptch、Smo、Gli1表达的变化

Ptch主要定位于胞质及胞膜。正常胰腺组织无Ptch表达。DMBA组胰腺癌组织Ptch阳性表达率为82.6%(38/46,图2),环巴明组为50.0%(7/14，图2)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

Smo主要定位于胞膜及胞质。正常胰腺组织均无Smo表达。DMBA组胰腺癌细胞组织Smo阳性表达率为73.9%(34/46，图2)，环巴明组为42.9%(6/14，图2)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05) 。

Gli1主要定位于胞核内。正常胰腺组织均无Gli1表达。DMBA组胰腺癌组织Gli1阳性表达率为65.2%(30/46，图2)，环巴明组为28.6%(4/14，图2)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2DMBA组(a)和环巴明组(b)组大鼠胰腺癌组织Ptch(上)、Smo(中)、Gli1(下)的表达(免疫组化 ×200)

讨 论

Hedgehog信号通路由Hedgehog配体、2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo以及下游转录因子Gli蛋白等组成。Hedgehog信号通路与某些恶性肿瘤的发生发展有关，在基底细胞癌、小细胞肺癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌等多种类型的恶性肿瘤中均可观察到Hedgehog信号通路的异常表达。

Thayer等[5]从26株胰腺癌细胞系筛选Hedgehog信号成员的表达，结果发现所有细胞株均检测到2种以上Hedgehog信号成员，认为Hedgehog

信号通路的异常活化参与了胰腺癌发生发展的过程。邵建国等[6]应用免疫组化检测20例人胰腺癌及其配对癌旁组织Ptch的表达，结果显示胰腺癌Ptch阳性表达率达55%，而癌旁胰腺组织无Ptch表达，认为Ptch可能参与了分化较好的胰腺癌组织的致癌过程。本结果显示，DMBA诱导的大鼠胰腺癌组织中Ptch、Smo和Gli1阳性率明显升高,而正常胰腺组织无表达，进一步证实胰腺癌组织存在Hedgehog信号通路的过度激活现象。

环巴明是Hedgehog通路的特异性抑制剂，它通过与Smo结合使Smo的空间构象发生改变，从而抑制Hedgehog信号通路的活性，发挥抗肿瘤作用[7]。Chen等[8]的实验研究均显示环巴明可诱导胰腺癌细胞凋亡，明显抑制癌细胞的生长和分化。本实验结果显示，环巴明干预后，DMBA诱发的胰腺癌发生率显著降低，肿块最大径亦明显缩小，同时胰腺癌组织中Hedgehog信号蛋白阳性表达率明显降低，进一步证实了环巴明通过抑制Hedgehog信号通路从而抑制胰腺癌的发生和发展。

[1] Chuang PT,McMahon AP.Vertebrate Hedgehog signaling modulated by induction of a Hedgehog-binding protein． Nature,1999，397：617-621．

[2] Ruizi Altaba A，Sanchez P，Dahmane N．Gli and hedgehog in cancer：tumours，embryos and stem cells．Nature Rev Cancer，2002，2：361-372．

[3] Wang WS,Chen PM,Su Y.Colorectal carcinoma: from tumorigenesis to treatment.Cell Mol Life Sci,2006,63:663-671.

[4] Gongoll S,Peters G,Mengel M,et al.Prognostic significance of calcium binding protein S100A4 in colorectal cancer.Gastroenterology,2002,123:1478-1484.

[5] Thayer SP，Di Magliano MP，Heiser PW，et al．Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis．Nature，2003，425：851-856．

[6] 邵建国,许国铭,屠振兴,等.胰腺癌组织中PTCH蛋白免疫组化检测.第二军医大学学报，2005,26:950-951.

[7] Taipale J，Chen JK，Cooper MK，et al．Effects of oncogenic mutations in smoothened and patched can be reversed by cyclopamine．Nature，2000，406：1005-1009．

[8] Chen X,Horiuchi A,Kikuchi N,et al.Hedgehog signal pathway is activated in ovarian carcinomas,correlating with cell proliferation: it′s inhibition leads to growth suppression and apoptosis.Cancer Sci,2007,98:68-76.

2011-03-16)

(本文编辑：屠振兴)

Expressionofhedgehogsignalpathway-relatedproteininthedevelopmentofpancreaticcancerofrat

XIAWei,WANGLuo-wei,JIANGFei,HUANGLing,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

WANGLuo-wei，Email：wangluoweimd@126.com

Pancreatic neoplasms； Hedgehog messenger pathway； Cyclopamine； Immunohistochemistry

AbtractObjectiveTo explore the expression and significance of hedgehog signal molecules (Ptch, Smo and Gli1) in pancreatic cancer.MethodsTwo hundred SD rats were randomly divided into DMBA group (group A,n=90), cyclopamine intervening group (group B,n=90) and control group (group C,n=20). For group A and B, DMBA was directly implanted into the parenchyma of the pancreas to establish the model of pancreatic cancer. The rats in group B were treated with 6.25 ml/kg cyclopamine and DMSO solution intraperitoneally daily. All rats were sacrificed four months later to observe the pancreatic tissue pathologic changes, and immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Ptch, Smo, Gli1 protein in pancreatic cancer and normal pancreatic tissue.ResultsThe prevalence rate of pancreatic cancer in group A was 57.5%(46/80), the maximum size of the tumor was 0.5～>2 cm; the prevalence rate of pancreatic cancer in group B was 17.1%(14/82), the maximum size of the tumor was 0.5～2.0 cm, and the difference between the two group was statistically significant (P<0.05). The positive expression rate of Ptch, Smo and Gli1 protein was 82.6%, 73.9% and 65.2% in DMBA group, and was 50.0%, 42.9% and 28.6% in cyclopamine group, and the difference between the two group was statistically significant (P<0.05). Ptch, Smo and Gli1 protein was expressed in normal pancreatic tissue.ConclusionsDirect implantation of DMBA in the parenchyma of rat pancreas can induce pancreatic cancer with a high incidence in a short time.Hedgehog signal protein expression is significantly increased, cyclopamine can inhibit the occurrence and progression of pancreatic cancer by inhibiting Hedgehog messenger expression．

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.011

国家自然科学基金资助项目(30700360)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

王洛伟，Email：wangluoweimd@126.com