正交实验设计优化光敏剂紫红素-18的合成工艺

王 曜，姚建忠，缪震元，盛春泉，张万年

(第二军医大学药学院，上海 200433)

正交实验设计优化光敏剂紫红素-18的合成工艺

王 曜，姚建忠，缪震元，盛春泉，张万年

(第二军医大学药学院，上海 200433)

目的优化光敏剂紫红素-18 (1)的合成工艺。方法以脱镁叶绿酸a(2)为原料，经空气氧化及碱开环制得化合物1；选择影响其合成产率的反应时间(A)、氢氧化钾溶液浓度(B)、反应溶剂(C)和化合物2与氢氧化钾的质量投料比(D)为考察因素，每个因素各取三个水平，采用L9(34)正交试验法优化目标物1的最佳合成工艺。结果合成目标物1的最优反应条件为B1C2A2D2，反应工艺收率从34.4%提高到45.6%。结论新工艺提高了收率、缩短了反应时间、消除了毒性溶剂，适合工业化生产。

药物化学；工艺改进；紫红素-18；正交设计；光敏剂

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗新技术。其治疗基础为用一定波长的光辐照富集光敏剂的肿瘤组织，由光敏剂诱发光动力效应，导致肿瘤组织坏死而显示治疗作用[1]。紫红素-18(1)为叶绿素a降解衍生物，研究表明[2]，其对小鼠实体肉瘤-180移植瘤具有可靠的光动力学疗效，与目前国内外临床使用的光敏剂如血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative，HpD)等卟啉混合物制剂相比，它具有化学结构明确、红光治疗区(λ>600 nm)吸收系数较卟啉类制剂高一个数量级、光敏作用强，且在体内清除速度快、毒性小等特点，是新一代有希望的光动力治癌候选药物。

文献[3]报道，以蚕沙叶绿素a粗提物(糊状叶绿素)经酸降解制得的脱镁叶绿酸a(2)粗品(HPLC检测纯度为55%)为原料，在氢氧化钾作用下通空气氧化开环反应可制得目标化合物1(图1)，但其反应收率偏低，为34.4%。本设计旨在利用正交实验设计优化其合成反应工艺，提高其合成收率。

叶绿素a 2 1

1 材料与方法

HPLC法测定用Water-600型高效液相仪(美国)，分离柱：ZORBAX ODS柱(0.46 cm×25 cm)，流动相：60%THF水溶液+10% 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，流速：1 ml/min，检测波长：401 nm，灵敏度：0.1 AUFS。柱层析硅胶H(60型)由青岛海洋化工集团公司出品。糊状叶绿素由浙江省海宁市天然色素厂生产。脱镁叶绿酸a(2)粗品按文献方法制备，其余所用化学试剂均为市售分析纯。

1.1正交实验设计 为了优化合成目标化合物1的最佳反应条件，采用正交设计[4]对反应条件进行优选。根据反应的性质和文献条件，重点考察了影响原料2在碱作用下经空气氧化开环合成目标物1产率的通空气反应时间(A)、氢氧化钾溶液浓度(w/v，B)、溶剂(C)和氢氧化钾与原料2的质量投料比(Y∶X，D)四个主要因素，每个因素各取三个水平(见表1)。

表1 正交实验设计因素水平表

1.2紫红素-18(1)的合成 称取X克脱镁叶绿酸a(2)粗品(HPLC检测纯度为55%)溶于3X ml四氢呋喃，加入20X ml乙醚稀释，再加入Y克某浓度(g/ml，B)氢氧化钾的某溶剂(C)溶液，搅拌条件下通空气反应一定时间(A)，停止反应。加入2倍体积量的水，分取水层，用10%硫酸调节pH至5～6，过滤，干燥，得黑色粉末1粗品，HPLC测定其相对纯度。

2 结果

按L9(34)正交表的实验序号顺序，依次采用表中相应条件重复进行3次平行实验，每次实验均以同一批号2粗品5.0 g(HPLC检测相对含量为55%，理论上含2纯品2.75 g)溶于15 ml四氢呋喃，加入100 ml乙醚稀释，再加一定量(D )某浓度(B)的氢氧化钾某溶剂(C)溶液，通空气反应一定时间(A)，所得1粗品均为4.4 g，非常稳定。用HPLC色谱法测定1粗品的相对百分含量即纯度来衡量其产率的高低。

极差分析数据和计算结果见表2。正交分析所用正交表各列除因子列以外，无空白列作对照，所以采用重复实验方差分析的方法[5]，计算各因子列的F比值，方差分析结果见表3。

表2 L9(34)正交试验结果及的极差分析数据

表3 方差分析结果

F0.05(2,18)=3.55；F0.01(2,18)=8.28

3 讨论

3.1紫红素-18(1)合成反应条件的优化

3.1.1反应时间(A)的影响 方差分析结果表明，反应时间对产物的收率有显著的影响(P<0.05)。极差(R)分析结果显示，反应时间从0.5 h延长至1 h，收率显著提高，但随着反应时间的进一步延长，收率不升反降。因此，反应时间以1 h即A2条件为佳。

3.1.2碱浓度(B)的影响 方差分析结果表明，氢氧化钾浓度对产物收率的影响非常显著(P<0.01)，极差分析结果显示，其对产物收率的影响最大，且产物收率随碱浓度的升高而增加。因此，氢氧化钾浓度选用25%(g/ml)，即B1条件为宜。

3.1.3溶剂(C)的影响 方差分析结果表明，溶剂对产物收率的影响也非常显著(P<0.01)，但极差分析结果显示，其对产物收率的影响要弱于碱浓度对收率的影响。以正丙醇为溶剂，收率最高；换以正丁醇为溶剂，收率稍有下降；而以乙醇为溶剂，收率显著下降。因此，反应溶剂选用正丙醇即C2条件为佳。

3.1.4投料比(D)的影响 极差分析和方差分析结果均表明，氢氧化钾与脱镁叶绿酸a(2)粗品的质量投料比对产物收率的影响最小，其中，相对以1∶3为质量投料比，所得产物收率最高。因此，氢氧化钾与脱镁叶绿酸a(2)粗品的质量投料比选用1∶3即D2条件为佳。

3.1.5紫红素-18(1)合成反应的最优条件 表3方差分析表明，因素B、C对实验结果的影响均非常显著(P<0.01)，因素A对实验结果也有显著影响(P<0.05)，但因素D对实验结果的影响不显著。表2极差(R)分析结果进一步显示，各因素对产物1粗品收率(纯度)的影响按B>C>A>D顺序递减。综上分析，制备紫红素-18(1)的最优反应条件应为B1C2A2D2。

3.2紫红素-18(1)最优合成反应条件的验证 以2粗品15.0 g(HPLC检测纯度为55%，理论上内含纯品8.25 g，13.94 mmol)按上述最优反应条件即溶于45 ml四氢呋喃，加入300 ml乙醚稀释，再加入25%(w/v)的氢氧化钾正丙醇溶液20 ml，通空气反应一定时间1 h，重复实验3批，平均每批得1粗品12.6 g，HPLC色谱检测所得1粗品的相对百分含量(纯度)非常稳定，平均为59.4%。

上述3批1粗品分别用硅胶H柱色谱法分离，以氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(10∶1∶1∶0.1，v / v / v / v)洗脱，平均得1纯品3.6 g(HPLC检测纯度为99.5%)，反应工艺的平均收率为45.6%。

4 结论

本工艺以正交实验设计对紫红素-18(1)的合成反应条件进行优化，获得了最佳反应条件B1C2A2D2。在此条件下，以放大量的同一批号脱镁叶绿酸a(2)粗品15.0 g(HPLC法检测纯度为55%)为原料，进行3次重复验证实验，所得1粗品的相对百分含量(纯度)基本一致且相对稳定，并与小样正交实验优选结果吻合，说明正交试验优选出的合成工艺条件合理且稳定可行。与文献[3]相比，该合成反应条件以四氢呋喃替代了有毒溶剂吡啶，减少了碱及溶剂的用量并缩短了反应时间，工艺收率也从34.4%提高到45.6%，因此，本实验结果为紫红素-18(1)较大规模的制备、分离提供了科学依据。

[1] 袁 媛，周传农.光动力治疗诱导肿瘤细胞凋亡的分子作用机制[J].中国激光医学杂志，1996, 5(2): 111.

[2] 沈卫镝，姚建忠，方 勇，等. 叶绿素a降解产物紫红素-18的光动力效应[J].中国医药工业杂志，2001, 32(5): 217.

[3] 姚建忠，许德余，陈文晖，等. 蚕沙叶绿素的降解及二氢卟吩P6酰胺衍生物的合成[J].中国医药工业杂志，1999, 30(9): 403.

[4] 周怀梧. 医药用数理统计[M]. 济南：山东教育出版社，1986：148.

[5] 张春华，严云良. 医药用数理统计[M]. 北京：科学出版社，2001：205.

2010-06-17

[修回日期] 2010-11-01

Optimizationofthesynthesisofphotosensitizerpurpurin-18byorthogonaldesign

WANG Yao，YAO Jian-zhong，MIAO Zhen-yuan，SHENG Chun-quan，ZHANG Wan-nian

(School of Pharmacy, The Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo optimize the synthesis of photosensitizer purpurin-18(1).MethodsTarget compound 1 was synthesized through air oxidation and simultaneously ring cleavage of pheophorbide a (2) in presence of alkali. Four main factors influencing synthetic yield of 1 such as reaction time (A), concentration of potassium hydroxide (B), solvent (C) and weight ratio of material 2 to potassium hydroxide (D)，which was chosed three levels respectively，were evaluated by the orthogonal experimental design of L9(34).ResultsThe optimization term of the synthesis of target compound 1 was B1C2A2D2. The yield of 1 was raised from 34.4% to 45.6%.ConclusionThe yield was raised. The reaction time was shortened and the toxic solvent was removed. The procedure was suitable for industrial production.

medicinal chemistry; process improvement; purpurin-18; orthogonal design; photosensitizer

国家自然科学基金(30371737)和上海市重点学科建设基金(B906)资助项目.

王 曜(1988-)，女，上海海洋大学食品学院生物技术(海洋制药)2007级本科生.E-mail:wysh@xnmsn.cn.

姚建忠. Tel：(021)81871235， E-mail:yaojz@sh163.net.

张万年.E-mail:zhangwnk@hotmail.com.

R914.5

A

1006-0111(2011)02-0114-03