5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相关基因的变化

张海峰 秦金丹 周国雄 丁晓凌 黄介飞

5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相关基因的变化

张海峰 秦金丹 周国雄 丁晓凌 黄介飞

目前认为，5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代谢途径异常是促进多种肿瘤发生、发展的重要原因之一。其机制为促进细胞过度增殖、抑制凋亡；促进恶性肿瘤血管生成；提高恶性肿瘤发生及转移的潜能、增加肿瘤细胞的侵袭力；抑制5-LOX能使多种恶性肿瘤细胞增殖减低并诱导细胞凋亡[1]。

本实验利用基因芯片检测靶向5-LOX的shRNA真核表达载体导入SW1990细胞形成的裸鼠皮下移植瘤内并联合雷公藤内酯醇(TL)治疗后移植瘤组织基因表达谱的变化，探讨沉默5-LOX基因表达治疗胰腺癌的应用价值。

一、材料与方法

1．裸鼠移植瘤模型制作及分组：取对数生长期SW1990细胞，调整浓度为1×108个/ml，分装于1 ml的无菌EP管中备用。18只BALB/cnu/nu裸鼠购自解放军南京军区医学动物实验中心，在SPF级屏障环境内饲养。取0.1 ml混匀的细胞悬液，注入每只裸鼠右侧腋下。待移植瘤长至100 mm3左右(约10 d)按数字表法随机分为靶向5-LOX的shRNA组、shRNA+TL组和对照组，每组6只。shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo-ALOX5-1021由上海吉玛公司构建，正义链5′-CACCGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTTCAAGAGAATACAGCA-AGCAGATGGGAGCTTTTTTG-3′；反义链5′-GATCCAAAA-AAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′。shRNA瘤内注射量为50 μg/只(0.1 ml)，3 d一次，共7次；TL腹腔内注射剂量为0.25 mg/kg体重(0.2 ml)，每天一次，共19 d。第30天处死动物，取肿瘤组织，称瘤重。取部分瘤组织，置-80℃冰箱保存。

2．移植瘤基因表达谱的检测：采用Trizol试剂抽提移植瘤组织总RNA，采用 Cy5荧光标记，应用基因表达谱寡核苷酸芯片(31118个基因，上海生物芯片公司)进行杂交，杂交条件：50℃ 16 h后 42℃洗片。芯片结果应用 Agilent扫描仪扫描，采用 Genespring行 Normalize分析，处理组/对照组比值≥2为上调基因，≤0.5为下调基因。

3．RT-PCR验证血管内皮生长因子(VEGF)的表达：采用RT-PCR方法检测。VEGF引物序列：上游5′-GGGCCT-CCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCAC-ACAG-3′， 扩增片段260 bp；内参β-actin引物序列：上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCT-CCCCTGTG-3′扩增片段486 bp。引物由上海invitrogen公司合成。PCR反应条件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30次循环，72℃延伸7 min。

二、结果

1．一般情况：注射SW1990细胞悬液后裸鼠生长状况良好，饮食以及活动正常，未出现惊恐、不安、拒食等情况。各组裸鼠治疗前后的体重的改变无明显差异(表1)。

2．裸鼠肿瘤生长情况：治疗组肿瘤的生长速度减慢，移植瘤体积均小于同时点的对照组。第30天对照组平均瘤体积是用药前的7.01倍；shRNA组是用药前的3.11倍；shRNA+TL组是用药前的1.97倍(图1)。两治疗组的瘤重均较对照组显著降低(P<0.05)，抑瘤率均达50%以上，但两治疗组间无显著差异(表1)。

图1注射SW1990细胞4周时shRNA+TL组(a)、shRNA组(b)和对照组(c)裸鼠的移植瘤生长情况

表1 各组裸鼠体重、移植瘤重及抑瘤率

注：与对照组比较，aP<0.05

3．差异表达基因：shRNA组上调基因401条，下调基因751条；shRNA +TL组上调基因760条，下调基因1254条。两组共同下调的基因主要包括G蛋白耦联受体基因、代谢相关基因、细胞周期相关基因、细胞黏附相关基因及生长因子基因等，其中有VEGF、成纤维细胞生长因子、肝细胞核因子、脂氧合酶同源性序列、表皮生长因子、NFkB 活化蛋白、血小板衍生生长因子、内皮细胞生长因子、转录激活因子等(图2)。经RT-PCR验证，两治疗组VEGF mRNA表达较对照组明显减弱(图3)。

图3 各组移植瘤组织VEGF表达(RT-PCR)

讨论众多研究证实，胰腺癌组织中5-LOX mRNA及蛋白表达明显增高，而正常胰腺组织中未见表达。抑制5-LOX的表达可导致胰腺癌细胞增殖抑制、凋亡增加[2-3]。我们先前的研究表明，5-LOX抑制剂齐留通、雷公藤内酯醇等处理胰腺癌SW 1990细胞后，细胞5-LOX mRNA和蛋白表达均明显下降，凋亡增加；同时VEGF表达下调；应用靶向5-LOX的shRNA质粒表达载体同样可有效阻断SW1990细胞5-LOX基因表达，抑制细胞增殖及诱导其凋亡[4-8]。本实验应用靶向5-LOX的shRNA载体瘤内注射加或不加雷公藤内酯醇注射制剂腹腔内注射的方法治疗裸鼠皮下移植瘤，两治疗组的抑瘤率均超过50%，但两种治疗方法的疗效无显著差异，无联合治疗的必要。通过基因芯片检测，两组共同下调的基因主要包括G蛋白结合受体基因、代谢相关基因、细胞周期相关基因、细胞黏附相关基因及生长因子基因等，提示5-LOX代谢通路可以通过多条途径影响生长因子基因的表达从而影响肿瘤细胞的增殖、分化，抑制肿瘤的生长、转移。

[1] 李勇，李建英，王小众.5-脂氧合酶促癌机制研究进展.世界华人消化杂志，2006，14：800-804.

[2] Hennig R,Grippo P,Ding XZ, et al. 5-Lipoxygenase, a marker for early pancreatic intraepithelial neoplastic lesions. Cancer Res,2005,65:6011-6016.

[3] 吴深宝，周国雄，张弘，等.胰腺癌细胞中5-脂氧合酶mRNA和蛋白的表达.胰腺病学,2005,4:238-239.

[4] 周国雄，吴深宝，黄介飞，等.5-脂氧合酶特异性抑制剂对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响.中华消化杂志,2005,25:689-691.

[5] Zhou GX， Ding XL， Huang JF， et al． Suppression of 5-lipoxygenase gene is involved in triptolide-induced apoptosis in pancreatic tumor cell lines．Biochim Biophys Acta,2007,1770:1021-1027.

[6] 张海峰，周国雄，丁晓凌，等.抑制5-脂氧合酶表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响.中华胰腺病杂志,2009,2:27-30.

[7] Ye YN,Shin VY,Cho CH,et al.Contributory role of 5-lipoxygenase and its association with angiogenesis in the promotion of inflammation2associated colonic tumorigenesis bycigarette smoking.Toxicology,2004,15:179-188.

[8] Romano M,Catalano A,Nutini M,et al.5-lipoxygenase regulates malignant mesothelial cell survival:involvement of vascular endothelial growth factor.FASEB J,2001,15:2326-2336.

2010-10-15)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.023

江苏省重点医学人才项目(RC2007085)；江苏省卫生厅重大课题(K200602)

226001 江苏南通，南通大学附属医院消化科

周国雄，Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn