内分泌腺来源的血管内皮生长因子抑制胰腺癌细胞凋亡的信号转导机制研究

任丽楠 郭晓钟 邹德莉 刘峰

·论著·

内分泌腺来源的血管内皮生长因子抑制胰腺癌细胞凋亡的信号转导机制研究

任丽楠 郭晓钟 邹德莉 刘峰

目的探讨内分泌腺来源的血管内皮生长因子(EG-VEGF)在胰腺癌MiaPaCa细胞中抗凋亡作用及其相关分子机制。方法以50、100、200 ng/ml EG-VEGF处理细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白质印迹法检测细胞p42/44MAPK、STAT3蛋白表达及其磷酸化，检测抗凋亡蛋白Mcl-1的表达。应用G蛋白耦联非特异受体阻断剂PTX、Rsa/ERK信号通路阻断剂PD98059和JAK/STAT3信号通路阻断剂AG490预处理细胞1 h，观察Mcl-1蛋白表达的变化。结果100 ng/ml EG-VEGF可使MiaPaCa细胞的凋亡率从(28.4±4.6)%显著下降到(13.2±2.5)%(P<0.05)。50 ng/ml的EG-VEGF处理后，MiaPaCaⅡ细胞p42/44MAPK的磷酸化增加(1.735±0.019)倍；STAT3的磷酸化增加(21.810±0.052)倍，均较对照组显著增加(P值均<0.05),但100、200 ng/ml EG-VEGF没有进一步增加蛋白的磷酸化。50 ng/ml的EG-VEGF处理后，Mcl-1蛋白的表达较对照组增加(3.460±0.002)倍，但100、200 ng/ml EG-VEGF没有进一步增加蛋白的表达；应用PTX预处理后，Mcl-1蛋白表达的增加被完全抑制，用PD98059、AG490预处理后Mcl-1表达增加抑制率分别为52%和68%。结论EG-VEGF可抑制MiaPaCa细胞的凋亡，其机制可能与激活Ras-MAPK和JAK-STAT3信号转导通路及增加Mcl-1蛋白的表达有关。

胰腺肿瘤； 血管内皮生长因子； 细胞凋亡； 信号转导

内分泌腺来源的血管内皮细胞生长因子(endocrine glands-derived vascular endothelial growth factor，EG-VEGF，又称 PK1)是近年来发现的具有组织特异性的血管内皮生长因子。它可调控肿瘤细胞的多种生物学功能，但对胰腺癌的调控作用目前尚无文献报道。本实验旨在观察EG-VEGF对人胰腺癌细胞株MiaPaCa Ⅱ细胞凋亡的影响，探讨其相关信号转导的分子机制。

材料和方法

一、流式细胞仪检测细胞凋亡

人胰腺癌高转移细胞系MiaPaCa Ⅱ由瑞士伯尔尼大学Friess博士惠赠。细胞接种于6孔板，常规培养。待细胞贴壁后将培养基换成无血清DMEM培养过夜，培养上清中加入终浓度为100 ng/ml的重组人EG-VEGF(Peprotech公司)，对照组上清不加EG-VEGF，每组设3个复孔。继续培养24 h后加入AnnexinⅤ-PI(BD PharMingen)染色，流式细胞仪检测凋亡率。

二、蛋白质印迹法检测p42/44MAPK、磷酸化p42/44MAPK (P-p42/44MAPK)、STAT3、P-STAT3及Mcl-1蛋白表达

MiaPaCa Ⅱ细胞贴壁后用无血清DMEM培养过夜的细胞培养上清中加入终浓度为50、100、200 ng/ml的EG-VEGF，以不加EG-VEGF细胞作为对照，继续培养20 min。收集细胞，提取细胞总蛋白，应用蛋白质印迹法检测p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3蛋白表达。鼠抗人p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3一抗(均购自Cell Signaling公司)以及内参抗β-actin一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)均1∶1000稀释；鼠抗人Mcl-1(R&D Systems公司)一抗以1∶500稀释；辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中山生物有限公司)1∶5000稀释。最后ECL发光，图像扫描仪扫描。以目的条带与β-actin条带灰度比值表示蛋白相对表达量。以对照组的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白比值作为1，计算实验组的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白比值的增加倍数。

此外，在无血清DMEM培养过夜的MiaPaCaⅡ细胞培养基中分别加入G蛋白耦联非特异受体阻断剂PTX(终浓度为 200 ng/ml，公司)、Rsa/ERK信号通路阻断剂PD98059(终浓度为50 μmol/L)和JAK/STAT3信号通路阻断剂AG490 (终浓度为100 μmol/L)预处理细胞1 h，以单加DMSO为DMSO组。随后吸尽培养上清，加入终浓度为100 ng/ml EG-VEGF的培养基继续培养 2 h，以不加EG-VEGF为对照组。应用蛋白质印迹法检测处理前后细胞的Mcl-1蛋白表达。以目的条带与β-actin条带灰度比值表示蛋白的相对表达量，以对照组为1，计算实验组Mcl-1蛋白表达的增加倍数。

三、统计学分析

实验数据用SPSS11.0软件包，两组均数间比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、EG-VEGF对MiaPaCaⅡ细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ-PI染色后，单绿色着色为早期凋亡细胞，单红色为晚期凋亡细胞，红色和绿色共同着色为凋亡中期细胞(图1)。对照组的细胞凋亡率为(28.4±4.6)%，100 ng/ml EG-VEGF处理组的细胞凋亡率为(13.2±2.5)%，较对照组显著降低(P<0.05)。

图1 MiaPaCaⅡ细胞的凋亡状况(AnnexinⅤ-PI染色)

二、EG-VEGF对细胞p42/44MAPK、STAT3磷酸化的影响

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF处理后，MiaPaCaⅡ细胞p42/44MAPK的磷酸化分别增加(1.735±0.019)、(1.943±0.022)、(1.930±0.054)倍； STAT3的磷酸化分别增加(21.810±0.052)、(28.850±0.048)、(28.870±0.054)倍(图2a、b)，但各浓度间增加磷酸化的程度无显著差异。

三、EG-VEGF对细胞Mcl-1 蛋白表达的影响

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF处理后，MiaPaCaⅡ细胞Mcl-1的表达量较对照组分别增加(3.460±0.002)、(3.900±0.002)、(3.940±0.003)倍(图2c)。但各浓度间表达的增加程度无显著差异。

图2不同浓度EG-VEGF对细胞p42/44MAPK(a)、STAT3(b)磷酸化及Mcl-1蛋白表达(c)的影响

四、相关信号转导通路阻断剂对细胞Mcl-1表达的影响

DMSO组、PTX组、PD98059组、AG490组的Mcl-1蛋白表达量较对照组分别增加(2.320±0.005)、(0.940±0.003)、(1.870±0.006)、(1.250±0.005)倍。PTX完全阻断EG-VEGF对Mcl-1表达的增强作用，而PD98059及AG490阻断EG-VEGF对Mcl-1表达的增强作用分别为52%和68%(图3)。

图3 相关信号通号阻断剂对Mcl-1蛋白表达的影响

讨 论

EG-VEGF(PK1)是2001年被确认的组织特异性的血管内皮生长因子[1]，仅仅作用于生成类固醇组织的细胞。它有两个G蛋白耦联受体PKR1和PKR2[2]，与受体结合后激活丝裂酶原活化蛋白酶p42/44和磷脂酰肌醇3-激酶信号通路，导致内皮细胞增殖、迁移和存活[3]。但对其调控胰腺癌细胞凋亡的作用及机制目前尚无相关报道。

本结果显示， EG-VEGF能抑制MiaPaCa Ⅱ细胞的凋亡，可促进p42/44MAPK的磷酸化，激活Ras-MAPK信号通路，与文献报道相一致[3-4]。同时，本结果显示，EG-VEGF可促进STAT3的磷酸化，激活JAK-STAT3信号通路。有关研究尚未见有类似的报道。

Mcl-1是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，在胰腺癌凋亡的过程中扮演重要作用[5]。本结果显示，一定剂量的EG-VEGF可促进Mcl-1的表达，应用PTX可相对完全地阻断EG-VEGF对Mcl-1的调控作用，这是因为PTX阻断了EG-VEGF与受体的结合所致[6]。这一结果一方面提示EG-VEGF对Mcl-1的调控关系，另一方面也反映其可在胰腺癌细胞中激活相关信号转导通路，上调抗凋亡蛋白的表达。由于EG-VEGF的组织特异性，故其在胰腺癌的研究中有可能成为诊断和治疗的新靶点。

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2010-11-02)

(本文编辑：屠振兴)

InvestigationofthesignaltransductioninEG-VEGFinhibitingpancreaticcancercellsfromapoptosis

RENLi-nan,GUOXiao-zhong,ZOUDe-li,LIUFeng.

GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommend,Shenyang110840,China

Correspondingauthor:GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis effects of EG-VEGF on pancreatic cancer cell MiaPaCa and its molecular mechanism.MethodsThe cells were treated with 50, 100, 200 ng/ml EG-VEGF. Flow cytometry was used to determine the apoptosis. The expression of p42/44MAPK, STAT3 protein and the phosphorylation, and anti-apoptosis protein Mcl-1 was evaluated by Western blot. Non-specific G protein-coupled receptor antagonist PTX, Rsa/ERK signal transduction blockade PD98059, JAK/STAT3 signal transduction blockade AG490 were used to treat the cells for 1 h, and the change of Mcl-1 protein was observed.ResultsAfter treated with 50 ng/ml EG-VEGF, the apoptosis rate of MiaPaCa was decreased from (28.4±4.6)% to (13.21±4.65)% (P<0.05); the phosphorylation of p42/44MAPK increased by 1.735±0.019 folds; the phosphorylation of STAT3 increased by 21.810±0.052 folds; the expression of Mcl-1 protein increased by 3.460±0.002 folds when compared with that of control group,and the difference was statistically significant (P<0.05). But the degree of phosphorylation and the expression of Mcl-1 were not further increased with 100, 200 ng/ml EG VEGF treatment. After PTX pre-treatment, the increase of Mcl-1 protein expression was completely inhibited, and after PD98059, AG490 pre-treatment, the increase of Mcl-1 expression was inhibited to 52% and 68%.ConclusionsEG-VEGF can inhibit MiaPaCa cell from apoptosis, and the mechanism may be related with activation of Ras MAPK and JAK STAT3 signal transduction pathway and up-regulation of Mcl-1.

Pancreatic neoplasm; Vascular endothelial growth factor; Apoptosis; Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.015

110840 沈阳，沈阳军区总医院消化内科

郭晓钟，Email:guoxiaozhong1962@163.com