脱脂米糠蛋白和多糖的脉冲超声辅助提取技术研究

李前进 马海乐 李树君 李云亮 曲文娟

(江苏大学食品与生物工程学院1，镇江 212013)

(中国农业机械化科学研究院2，北京 100083)

脱脂米糠蛋白和多糖的脉冲超声辅助提取技术研究

李前进1马海乐1李树君2李云亮1曲文娟1

(江苏大学食品与生物工程学院1，镇江 212013)

(中国农业机械化科学研究院2，北京 100083)

采用脉冲超声技术对脱脂米糠中蛋白和多糖进行同时提取，研究了液料比、提取时间、提取温度、超声发出时间和间歇时间因素对蛋白得率和纯度以及多糖得率和纯度的影响。在单因素试验的基础上，采用Box－Benhnken中心组合试验设计对脉冲超声辅助提取条件进行优化。试验结果表明:脱脂米糠蛋白和多糖的脉冲超声辅助提取最佳条件为:液料比9.5 mL/g，提取时间42.6 min，提取温度51.5℃，超声发出时间4 s，超声间歇时间2 s。在此最佳条件下，脱脂米糠蛋白和多糖的得率分别为3.0%和4.6%，纯度分别为45.6%和 76.8%。

脱脂米糠 蛋白 多糖 超声提取 响应面

米糠是大米工业化加工后的主要副产物，我国是世界上第一产稻大国，大米年产量约1.85亿吨，加工后可得到米糠约1 100万吨［1］，因此进行米糠的深加工和综合利用显得尤为重要。米糠蛋白中必需氨基酸组成更接近FAO/WHO的推荐模式，其营养价值可与鸡蛋相媲美。米糠多糖是一种结构复杂的杂聚糖，由木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成［2－3］。现代药理学研究表明:米糠多糖具有抗肿瘤、增强免疫功能等作用［4－5］。米糠多糖一般采用热水提取或是碱水提取法;米糠蛋白一般采用碱溶提取或是酶解提取法。由于米糠多糖和蛋白与米糠中的纤维和淀粉等成分存在着紧密的结合，且米糠稳定化方法对蛋白质的溶解性有很大的影响，使得米糠中的多糖和蛋白质不易被提取出来，目前存在提取效率不高、纯度不高和米糠原料利用不充分等问题。米糠多糖和米糠蛋白目前多数被单独提取，利用超声辅助提取技术进行提取的还处在初始阶段。由于米糠中的蛋白和多糖的总量均不超过5%，分别单独提取必然增加了最终产品开发的成本。基于上述分析，本试验提取了采用脉冲超声辅助提取技术对脱脂米糠中的多糖和蛋白进行同时提取的研究方案，以提取得率和纯度为指标，优化提取方法。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

脱脂米糠:兴化市南亭植物油厂;葡萄糖标准品和牛白蛋白标准品:国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸、苯酚、三氯乙酸、氢氧化钠、浓盐酸、福林酚试剂A和B:国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

聚能式超声辅助提取设备:无锡泛博生物工程有限公司;WFJ 7200型可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;PHS－3C精密pH计:上海精密科学仪器有限公司;AvantiJ－25高速冷冻离心机:Beckman公司;1010－3B型电热鼓风干燥箱:上海实验仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠蛋白和多糖分离提取的工艺流程

按照设定的液料比，称取一定量的脱脂米糠，加入超声辅助提取器中，加入10 L蒸馏水，系统升温至设定的温度，调整好超声发生器的工作参数，开启循环泵，开始超声辅助提取。提取结束后，搅拌均匀的状况下，取500 mL的提取液加入离心机在5 000 r/min的转速下进行固液分离，取上清液真空浓缩至固形物的5%，调节至pH 3.5，沉淀蛋白，在8 000 r/min的转速下离心分离出沉淀物，干燥得到粗蛋白;取离心上清液100 mL，加入400 mL的乙醇，沉淀多糖，在8 000 r/min的转速下离心分离出沉淀物，干燥得到粗多糖。

超声辅助提取的超声功率是210 W，提取液以循环的方式通过聚能式超声探头，循环泵的流量是7 000 mL/min。超声波采取间断脉冲的方式发出。

1.3.2 测定方法

蛋白含量的测定采用福林酚试剂法［6］;多糖含量的测定采用苯酚硫酸比色法［7］。

蛋白和多糖的得率计算为干燥后粗蛋白和粗多糖的质量与原料质量的比值。蛋白和多糖的纯度计算为粗蛋白和粗多糖中的蛋白和多糖含量。

1.3.3 单因素试验

单因素试验中分别研究了提取时间、提取温度、液料比、超声发出时间及超声间歇时间因素对蛋白和多糖提取效率(综合考虑得率及纯度)的影响。

1.3.4 响应面分析试验

在单因素试验的基础上，选取对提取效率影响较大的因素进行响应面分析。采用Box－Benhnken中心组合设计响应面试验，以蛋白和多糖的得率作为响应值，从而优化得出脉冲超声辅助同时提取脱脂米糠蛋白和多糖的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 液料比对蛋白和多糖提取效率的影响

在提取时间60 min、提取温度50℃、超声发出时间2 s及超声间歇时间2 s的条件下进行提取，液料比对脱脂米糠蛋白和多糖提取效果的影响如图1所示。

从图1中可以看出，随着液料比的不断增大，除了蛋白质得率变化不显著外，其他指标均呈现明显先上升后下降的趋势，在液料比10～15之间，米糠多糖的得率和纯度以及蛋白的纯度出现了一个最大值。随着液料比的提高，一方面因为溶剂的溶解动力增加，导致提取得率上升，另一方面，因提取液黏度降低，导致超声空化阻力下降，超声空化阀降低，有助于超声辅助提取效果的改善;随着液料比的进一步提高米糠多糖和蛋白的得率应该逐步趋于稳定，但图1多糖得率出现下降的原因主要因为试验方法所致，因为溶液过稀，多糖醇沉时聚集絮凝的难度加大，引起回收率下降［8］。因此，推荐的液料比为10∶1。

图1 液料比对蛋白和多糖得率和纯度的影响

2.2 提取时间对蛋白和多糖提取效率的影响

在液料比10∶1、提取温度50℃、超声发出时间2 s及超声间歇时间2 s的条件下进行提取，提取时间对脱脂米糠蛋白和多糖提取效果的影响如图2所示。

图2 提取时间对蛋白和多糖得率和纯度的影响

从图2可以看出，随着提取时间的延长，蛋白和多糖不断溶出，得率和纯度均呈现显著上升的趋势，达到20 min后，多糖和蛋白的得率趋于稳定。蛋白和多糖的纯度分别在40 min和60 min后有所下降，主要原因是一些难以溶出的杂质逐渐溶出。综合考虑蛋白和多糖的得率与纯度，推荐的提取时间为40 min。

2.3 提取温度对蛋白和多糖提取效率的影响

在液料比10∶1、提取时间40 min、超声发出时间2 s及超声间歇时间2 s的条件下进行提取，提取温度对脱脂米糠蛋白和多糖提取效果的影响如图3所示。

图3 提取温度对蛋白和多糖得率和纯度的影响

由图3可以看出，提取温度对蛋白和多糖的提取效率影响很显著，随着提取温度的不断升高，蛋白的得率和纯度以及多糖的纯度均是先增加后减少，多糖的得率开始时有个缓慢下降的趋势，之后开始升高，而蛋白的得率在60℃时出现明显的下降，这可能是由于温度过高导致蛋白质发生了变性，降低了其溶解度，或是达到了米糠中淀粉的糊化温度，影响蛋白的溶出。同时考虑到高温时能耗高，所以推荐的提取温度为不超过60℃。

2.4 超声发出时间对蛋白和多糖提取效率的影响

在液料比 10∶1、提取时间 40 min、超声温度50℃、超声间歇时间2 s的条件下进行提取，超声发出时间对脱脂米糠蛋白和多糖提取效果的影响如图4所示。

图4 超声发出时间对蛋白和多糖得率和纯度的影响

由图4可以看出，脉冲式超声波的超声发出时间为4 s时，蛋白和多糖得率均达到最大值，随后出现下降趋势。多糖的纯度在2 s和4 s之间出现了一个峰值，超过4 s之后开始缓慢的上升，蛋白的纯度先缓慢的下降接着又缓慢的上升。综合考虑，推荐的超声发出时间为4 s。

2.5 超声间歇时间对蛋白和多糖提取效率的影响

在液料比 10∶1、提取时间 40 min、超声温度50℃、超声发出时间4 s的条件下进行提取，超声间歇时间对脱脂米糠蛋白和多糖提取效果的影响如图5所示。

由图5可以看出，脉冲式超声波的超声间歇时间为2 s的时候，蛋白和多糖纯度均出现了最大值，随后开始下降，随着超声间歇时间的不断延长，蛋白得率不断上升，多糖得率缓慢下降，故将超声间歇时间选择在2 s。

图5 超声间歇时间对蛋白和多糖得率和纯度的影响

2.6 Box－Behnken试验设计及分析结果

2.6.1 模型的建立及显著性分析

在单因素试验结果的基础上，根据 Box－Benhnken中心组合试验设计的原理［9］，选取对蛋白和多糖提取效率影响显著的3个因素:液料比(X1)，提取时间(X2)，提取温度(X3)，设计一个3因素3水平的Box－Benhnken中心组合试验，考察3个因素对蛋白得率和多糖得率(响应值)的影响。Box－Benhnken中心组合设计的因素和水平见表1，试验设计与结果见表2。

中心组合试验采取的脉冲式超声波超声发出时间为4 s、间歇时间2 s。

表1 Box－Benhnken中心组合设计的因素和水平表

表2 Box－Benhnken中心组合的试验设计与结果

利用Design－Expert 7.1软件对试验所得的蛋白得率(Y1)和多糖得率(Y2)分别进行多项式回归分析，得到的二次多项式回归方程如下:

对回归方程式(1)进行方差分析，结果见表3。如表 3 所示，F模型为23.06 大于 F0.01(9，4)=14.66;F失拟为6.52 小于 F0.01(9，4)，这表明建立的二次多项式回归模型是显著地，且对试验结果的拟合情况良好，因此该模型可以很好对脉冲超声辅助提取脱脂米糠蛋白和多糖试验进行分析和预测。同时发现，因素X21小于0.000 1，说明该因素效应极其显著;X1，X3，X1X2，X1X3和 X23小于 0.05，说明这些因素的影响较显著;X2X3和X22大于0.05，说明这两个因素的影响不显著。由此得出:在本试验范围内，液料比和提取温度对蛋白得率的影响最大，提取时间的影响次之。根据以上分析，剔除其中不显著因素，得到最终的蛋白得率回归方程为:

表3 蛋白得率方差分析表

对回归方程式(2)进行方差分析，结果见表4。如表 4 所示，其中 F模型为 22.29 大于 F0.01(9，4)=14.66;F失拟为3.10 小于 F0.01(9，4)，这表明该回归模型极其显著，对试验结果的拟合情况良好，可以用该方程对试验真实值进行分析和预测。因素X21的影响极显著;X2，X3，X1X2，X1X3和 X23的影响较显著，X2X3和X22的影响不显著。由此得出:本试验的范围内提取时间和提取温度对多糖得率的影响最大，液料比的影响次之。根据以上分析，剔除影响不显著因素，得到最终的多糖得率回归方程为:

表4 多糖得率方差分析表

2.6.2 Box－Benhnken中心组合试验提取条件的优化

利用Design－Expert 7.1软件的point prediction功能可以预测出蛋白和多糖得率两个响应值均达到最大时各因素的最佳值。当因子最佳值X1≈9.5，X2≈42.6，X3≈51.5，即液料比为 9.5 mL/g，提取时间为42.6 min，提取温度为51.5℃，在此最佳条件下，蛋白和多糖的得率分别为3.0%和4.6%，纯度分别为 45.6%和 76.8%。

王莉等［10］研究了米糠多糖的超声辅助提取技术，得率为2.87%，比常规热水浸提取技术的2.02%有显著提高;李东锐等［11］研究了米糠蛋白和多糖的超声辅助提取技术，蛋白和多糖得率分别为1%和0.5%。与现有的文献比较，本研究在超声功率大幅度减小的基础上，蛋白和多糖的提取得率得到显著提高，同时其纯度也比较高。

3 结论

3.1 液料比、提取时间和提取温度是影响米糠多糖和蛋白超声辅助提取的主要参数。

3.2 蛋白和多糖得率的回归方程分别为:

式中:X1为液料比，X2为提取时间，X3为提取温度。

3.3 通过单因素和Box－Benhnken中心组合试验确定了脱脂米糠中蛋白和多糖脉冲超声辅助提取的最优条件为:液料比9.5 mL/g、提取时间42.6 min、提取温度51.5℃、超声发生时间4 s和间歇时间2 s，在此最佳提取条件下蛋白和多糖的得率分别为3.0% 和 4.6%，纯度分别为 45.6% 和76.8% 。

［1］马海乐，张连波.米糠蛋白的脉冲超声辅助提取技术［J］.江苏大学学报:自然科学版，2007，27(1):14－17

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［11］李东锐，苏明华，汪海波，等.超声波及匀浆技术在米糠多糖和米糠蛋白提取中的应用研究［J］.粮油加工，2007:1－5.

Study on Pulsed Ultrasound－assisted Extraction of Protein and Polysaccharide from Defatted Rice Bran

Li Qianjin1Ma Haile1Li Shujun2Li Yunliang1Qu Wenjuan1
(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University1，Zhenjiang 212013)
(Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences2，Beijing 100083)

The pulsed ultrasonic technology was adopted to extract protein and polysaccharide from defatted rice bran.This research evaluated the effects on the yields and purities of protein and polysaccharide of extraction factors，including liquid to solid ratio，extraction time，extraction temperature，pulsed duration and interval times.Based on the single factor experiment，the response surface analysis was used to optimize the simultaneous extraction condition of protein and polysaccharide by the pulsed ultrasound －assisted extraction.The results showed that the optimum conditions of protein and polysaccharide from defatted rice bran by the pulsed ultrasound－assisted extraction were liquid to solid ratio of 9.5 mL/g，extraction time of 42.6 min，extraction temperature of 51.5 ℃，pulsed duration time of 4 s and pulsed interval time of 2 s.Under the optimum condition，the yields of protein and polysaccharide were 3.0%and 4.6%respectively and their purities were 45.6%and 76.8%respectively.

defatted rice bran，protein，polysaccharide，ultrasonic extraction，response surface analysis

TS201.9

A

1003－0174(2011)08－0005－06

科技部国际合作项目(2009DFA32000)

2010－10－12

李前进，男，1985年出生，硕士，分离提取

马海乐，男，1963年出生，教授，博士生导师，分离提取、功能食品