米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质及其消化产物抗氧化性的影响

何莉媛，吴 伟，吴晓娟，付旭恒，林亲录

(中南林业科技大学 食品科学与工程学院，稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410004)

米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质及其消化产物抗氧化性的影响

何莉媛，吴 伟，吴晓娟，付旭恒，林亲录

(中南林业科技大学 食品科学与工程学院，稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410004)

米糠贮藏；米糠蛋白；蛋白质氧化；体外消化；抗氧化性

米糠是稻米加工的副产物，我国米糠年产量在1 000万t以上，米糠营养价值丰富，其中蛋白质含量14%～20%[1]。米糠蛋白拥有过敏性低、营养价值高、功能性质好等优点，是食品工业中极有潜力的蛋白质资源[2]。米糠富含脂质和活性较强的脂肪水解酶和脂肪氧化酶，在糙米碾白过程中，米糠脂质在脂肪水解酶的作用下快速形成游离脂肪酸，使得米糠酸值迅速升高[3]。在贮藏和运输过程中，米糠内源脂肪氧合酶催化游离脂肪酸发生氧化反应，导致米糠氧化酸败[4]。米糠氧化酸败产物具有较强的生物活性，能够诱导米糠蛋白氧化，改变米糠蛋白的结构和功能性质[5-6]。因此，米糠在综合利用之前需要进行及时有效的稳定化处理，但米糠稳定化设备投资较高，而我国稻米加工企业分布较为分散，且大部分产能和投资较低，无法及时有效地对米糠进行稳定化处理，大部分米糠在稳定化之前已经发生了不同程度的酸败，其中米糠蛋白也发生了不同程度的氧化[5-7]。

蛋白质氧化是蛋白质分子在活性氧或次生氧化产物作用下发生的共价结构修饰[7]。蛋白质氧化不仅改变蛋白质的结构，而且影响其功能性质和营养品质[8]。大量研究表明蛋白质营养品质受氧化影响的程度与蛋白质氧化环境[9]、氧化程度[10]以及氧化蛋白质的种类[11]有关，并且大多数研究围绕肉类蛋白[8]和大豆蛋白[12-15]展开，鲜有研究关注米糠酸败引起的蛋白质氧化对米糠蛋白营养品质的影响。本文以新鲜米糠为原料，在一定条件下贮藏不同时间得到不同酸败程度的米糠，稳定化和脱脂后制备米糠蛋白，研究米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质及其消化产物抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜米糠：湖南粮食集团有限责任公司；胃蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：Biosharp公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、高硫酸钾、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：美国 Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

Sorvall LYNX 6000高速落地离心机：美国Thermo Fisher公司；DSI Z-300A水浴恒温振荡器；BlueStar紫外可见分光光度计；RV10旋转蒸发仪：德国IKA公司；FMHE36-24双螺杆挤压机。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠预处理

参考蔡勇建[7]米糠预处理方法。以新鲜米糠为原料粉碎过40目筛，在室温下分别贮藏0、1、3、5、10 d得到不同酸败程度的米糠，采用双螺杆挤压机稳定化处理，稳定化条件：喂料量15 kg/h，水分含量16%，双螺杆挤压机二区至六区温度依次为70、120、120、70、60℃；随后干燥、粉碎过40目筛备用。室温条件下将不同贮藏时间米糠与正己烷按1∶4料液比混合脱脂，振荡30 min后抽滤得到滤饼，滤液旋转蒸发回收正己烷，收集米糠毛油，滤饼重复脱脂3次。将滤饼置于通风橱中风干后得脱脂米糠。米糠毛油酸值测定参考GB/T 5530—2005，过氧化值测定参考GB/T 5538—2005。

1.2.2 米糠蛋白的制备

参考蔡勇建[7]制备米糠蛋白方法。将脱脂米糠与去离子水以1∶10混合，40℃下用2 mol/L NaOH将pH调节至9.0，搅拌4 h后将悬浮液在4℃条件下8 000 r/min离心20 min，上清液用2 mol/L HCl调pH至4.0，静置30 min后在4℃条件下8 000 r/min离心15 min，水洗沉淀3次后分散于去离子水中，并用2 mol/L NaOH调pH至7.0，冷冻干燥得到米糠蛋白。

1.2.3 米糠蛋白体外胃蛋白酶消化程度的测定

参考Chen等[13]的方法。将米糠蛋白溶解于去离子水中配制质量分数为2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl调pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保温酶解90 min，随后沸水浴5 min终止消化，10 000 r/min离心10 min后取上清液，取部分上清液用凯氏定氮法测定氮含量，剩余上清液配制0.6 mg/mL的待测液，用于测定米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物的抗氧化性。

1.2.4 米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的测定

参考Bax等[9]的方法。将米糠蛋白溶解于去离子水中配制质量分数为2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl调节pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保温酶解，分别在酶解0、5、10、20、30、40、60、90 min后加入终质量分数为15%的三氯乙酸终止反应，冰浴1 h后4℃下8 000 r/min离心15 min，取上清液在280 nm处测定吸光值。

1.2.5 米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化性的测定

2 结果与讨论

2.1 米糠贮藏时间对米糠毛油酸值、过氧化值以及米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率的影响(见表1)

表1 米糠贮藏不同时间米糠毛油的酸值、过氧化值以及米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率

注：数值为“平均值±标准偏差”，同一列肩标中不同字母表示在5%水平上差异显著，下同。

由表1可知，随着新鲜米糠贮藏时间延长到10 d，米糠毛油的酸值(KOH)和过氧化值分别从4.31 mg/g和1.42 mmol/kg增加到38.72 mg/g和7.79 mmol/kg，表明米糠贮藏期间米糠脂质发生了水解酸败和氧化酸败。蔡勇建[7]在相同条件下贮藏新鲜米糠，发现米糠贮藏时间由0 d延长到10 d时，米糠蛋白羰基含量从2.12 nmol/mg增至13.80 nmol/mg，表明米糠酸败氧化产物导致米糠蛋白氧化。随着新鲜米糠贮藏时间的延长，米糠蛋白在体外胃蛋白酶作用下的消化率先上升后下降，在米糠贮藏3 d时达到最大值，为39.73%，较新鲜米糠蛋白增加了30.65%，米糠贮藏10 d时的体外胃蛋白酶消化率已显著低于新鲜米糠(Plt;0.05)。Zhou等[10]研究氧化亚油酸浓度对猪肌原纤维蛋白体外消化率影响时发现，低浓度亚油酸导致猪肌原纤维蛋白胃蛋白酶消化率上升，高浓度亚油酸使得猪肌原纤维蛋白胃蛋白酶消化率下降，并认为蛋白质适度氧化可使得蛋白质结构展开，暴露出更多的胃蛋白酶作用位点，促进胃蛋白酶消化；蛋白质过度氧化导致蛋白质聚集，使得胃蛋白酶的作用位点减少，抑制胃蛋白酶消化。Chen等[12]研究丙二醛氧化修饰对大豆分离蛋白体外消化率影响时发现，丙二醛氧化大豆分离蛋白形成的聚集体是导致氧化大豆分离蛋白体外消化率下降的原因。研究[5,7]发现新鲜米糠较长时间的贮藏(5 d和10 d)可导致米糠蛋白形成氧化聚集体，米糠蛋白氧化聚集体主要由二硫键结合，少量非二硫键的共价键也参与米糠蛋白氧化聚集体的形成。由此可见，在新鲜米糠贮藏的前期，米糠酸败程度和米糠蛋白氧化程度都较低，适度氧化导致米糠蛋白结构展开，有利于胃蛋白酶酶解；在米糠贮藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸败程度和米糠蛋白氧化程度都较高，米糠蛋白氧化形成的共价交联氧化聚集体使得胃蛋白酶作用位点减少，从而抑制胃蛋白酶的酶解。

2.2 米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响(见图1)

图1 米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响

由图1可知，米糠蛋白体外模拟消化进程中，OD280变化趋势与Bax等[9]研究氧化猪肌原纤维蛋白体外胃蛋白酶模拟消化进程变化趋势相似。为了更好地表征胃蛋白酶消化进程，引入拟合指数曲线方程：

1/OD=1/ODmax×eβ(1/t)

式中：ODmax为消化完全时稳定的最大OD；β为描述曲线形状的系数。

参考Bax等[9]研究，引入半衰期(t1/2)表征达到0.5倍ODmax所需的消化时间，半衰期由方程推导而得：

t1/2=β/ln2

以半衰期对应的OD280计算初始消化速率。以米糠贮藏10 d为例，拟合曲线如图2所示，不同贮藏时间下的拟合曲线参数见表2。

图2 贮藏10 d时米糠蛋白体外胃蛋白酶消化拟合曲线

贮藏时间/d1/ODmaxODmaxβt1/2/minR204．580．21814．3420．690．9614．270．23413．9620．140．9733．690．27113．3419．250．9854．680．21414．1220．370．99106．750．14814．7021．210．99

由表2可知，随着米糠贮藏时间的延长，ODmax的变化趋势与消化率一致，最大值出现在新鲜米糠贮藏3 d。半衰期随米糠贮藏时间的延长先下降后上升，且大致位于20 min左右，与Bax等[9]研究胃蛋白酶消化进程的半衰期落在20 min左右结果相似。

米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶初始消化速率的影响如图3所示。

注：图中不同字母表示在Plt;0.05水平上差异显著。

图3米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶初始消化速率的影响

由图3可知，随着米糠贮藏时间的延长，米糠蛋白初始消化速率先增大后减小。在米糠贮藏初期，半衰期逐渐减小，初始消化速率逐渐增大，两者均在米糠贮藏3 d时达到极值，分别为19.25 min和0.381 h-1。Bax等[9]研究热处理对猪肌原纤维蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响时发现，随着热处理温度的升高，猪肌原纤维蛋白氧化程度增加，猪肌原纤维蛋白在胃蛋白酶中的初始消化速率先增大后减小，当热处理温度超过100℃时，初始消化速率、半衰期和ODmax逐渐趋于稳定，并认为适度热处理引发的适度氧化使得蛋白质暴露出更多的疏水区域，提高胃蛋白酶催化效率；过度热处理引发的蛋白质过度氧化可形成蛋白质共价交联聚集体，从而抑制胃蛋白酶的消化。在新鲜米糠贮藏的前期，米糠酸败程度不高，米糠蛋白适度氧化后有利于暴露出更多的疏水区域，增加胃蛋白酶酶解位点，使得初始消化速率上升、半衰期下降，提高了胃蛋白酶酶解速率，促进了米糠蛋白的消化；在米糠贮藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸败程度急剧增加，米糠蛋白剧烈氧化后形成大量的共价交联氧化聚集体，掩盖了米糠蛋白氧化初期暴露的胃蛋白酶位点，使初始消化速率下降、半衰期上升，从而减缓胃蛋白酶消化进程，抑制了米糠蛋白的消化。

米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化性的影响见表3。

表3 米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化性的影响

由表3可知，随着米糠贮藏时间的延长，米糠蛋白在胃蛋白酶酶解90 min后产物的抗氧化性先上升后下降，并且各项抗氧化性指标均在米糠贮藏3 d时最佳。Chen等[12]研究发现，蛋白质氧化可降低大豆分离蛋白体外消化产物的抗氧化性，并认为氧化修饰形成蛋白质氧化聚集体是造成大豆蛋白消化产物抗氧化性下降的原因。Zhou等[10]研究氧化亚油酸浓度对猪肌原纤维蛋白体外消化产物抗氧化性的影响时发现，随着氧化亚油酸浓度增加，猪肌原纤维蛋白氧化程度加深，而猪肌原纤维蛋白体外消化产物自由基吸收能力先上升后下降，并认为轻微氧化使蛋白质结构展开，暴露出更多抗氧化性好的氨基酸，有助于消化产物抗氧化性的提升；过度氧化不仅会造成蛋白质形成共价聚集体，还会带来氨基酸损失，尤其是拥有良好抗氧化性的氨基酸，从而极大降低消化产物的抗氧化性。由此可见，米糠贮藏期间，米糠蛋白消化产物抗氧化性的变化主要取决于米糠蛋白氧化后结构的变化。在新鲜米糠贮藏的前期(1、3 d)，米糠酸败程度较低，适度氧化导致米糠蛋白结构展开，有利于胃蛋白酶消化产物抗氧化性的增加；在米糠贮藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸败程度较高，米糠蛋白氧化程度加深，进一步形成共价交联氧化聚集体，将适度氧化后米糠蛋白结构展开的优势掩盖，使得胃蛋白酶消化产物抗氧化性降低。

还原能力是评估抗氧化剂提供氢或电子的能力。在新鲜米糠贮藏期间，米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物的还原能力先上升后下降，在米糠贮藏3 d时，还原能力达到最大值。在新鲜米糠贮藏的前期(1、3 d)，米糠酸败程度较低，米糠蛋白适度氧化后结构展开，提升了米糠蛋白提供电子的能力，有利于胃蛋白酶消化产物还原能力的增加；在米糠贮藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸败程度较高，米糠蛋白过度氧化后形成共价交联氧化聚集体，使米糠蛋白提供电子的能力下降，从而降低米糠蛋白胃蛋白酶消化产物的还原能力。

3 结 论

将新鲜米糠在室温下贮藏0、1、3、5、10 d，稳定化和脱脂后得到不同酸败程度的米糠，并以此制备不同氧化程度的米糠蛋白，通过体外胃蛋白酶消化，研究米糠贮藏时间对米糠蛋白消化性质及消化产物抗氧化性的影响。结果发现：随着米糠贮藏时间的延长，米糠毛油酸值和过氧化值迅速升高，米糠蛋白的胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化产物的抗氧化性都先上升后下降，且均在贮藏3 d时达到最佳。表明新鲜米糠的短期贮藏可一定程度上改善米糠蛋白的消化性质和消化产物的抗氧化性，有助于米糠蛋白营养品质的提升；但长期贮藏对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化有显著的负面影响，贮藏10 d后米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化产物的抗氧化性已显著低于新鲜米糠，极大地降低了米糠蛋白的营养品质和利用价值。

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Effectsofricebranstoragetimeoninvitropepsindigestibilityofricebranproteinandantioxidantactivityofricebranproteinhydrolysates

HE Liyuan, WU Wei, WU Xiaojuan, FU Xuheng, LIN Qinlu

(National Engineering Laboratory for Rice and By-Product Deep Processing, College of Food Science and Engineering, Center South University of Forestry and Technology, Changsha 410004，China)

rice bran storage; rice bran protein; protein oxidation; in vitro digestibility; antioxid-ant activity

TS210.9;TQ932

A

1003-7969(2017)11-0070-05

2017-02-02；

2017-07-20

公益性行业(农业)科研专项(201303071)；粮油深加工与品质控制2011湖南省协同创新项目(湘教通[2013]448号)；国家自然科学基金面上项目(31771918)

何莉媛(1992)，女，硕士研究生，研究方向为粮油加工(E-mail)hly9271@163.com。

通信简介：吴 伟，副教授，博士(E-mail)foodwuwei@126.com。