甘草附子汤对去卵巢大鼠骨组织中Ⅰ型胶原代谢及组织蛋白酶K表达的影响

李明慧，王桂敏

(辽宁医学院 1.研究生学院，2.附属第一医院 中医科，辽宁 锦州 121001)

绝经后骨质疏松症是指绝经后妇女由于卵巢功能下降，雌激素水平急剧下降，骨吸收大于骨形成，以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄为特征，以至骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨病。它是目前最为常见的骨代谢失调性疾病［1］。本研究旨在观察甘草附子汤对去卵巢大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)代谢和破骨细胞组织蛋白酶K(Cath K)表达的影响，探求温肾健脾方对绝经后骨质疏松的防治作用。

1 材料

甘草附子汤出自医圣张仲景《伤寒论》的原方［2］，由甘草、附子、白术、桂枝组成，自制;苯甲酸雌二醇(批号201009)，上海第九制药厂生产。

Ⅰ型前胶原羧基末端前肽(PICP)和Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(ICTP)测定试剂盒，美国RB公司;ColⅠ、Cath K试剂，购于北京博奥森生物科技有限公司。

SD雌性大鼠，3月龄，体重(240±20)g，本校动物实验研究中心，合格证号:辽实动2010-0015。

2 方法

2.1 分组

健康SD大鼠40只，雌性，3月龄，体重(240±20)g，分为5组，每组8只，分别为假手术组、模型组、甘草附子汤高、低剂量组和雌激素组。

2.2 造摸

去卵巢大鼠模型是目前公认为与临床最接近的绝经后骨质疏松动物模型［3］。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，取俯卧位，剪去背毛，常规消毒，铺手术巾;取背侧正中切口，在背部1-6腰椎位置剪开皮肤，向双侧钝性分离，用止血钳拉出游离的脂肪组织，找到粉红色的卵巢，在其与子宫连接处用0号丝线结扎，剪去卵巢组织，止血，并向腹腔内滴入链霉素注射液(8万单位/mL)数滴，再作肌层、皮肤缝合［4］。假手术组仅摘除卵巢附近的脂肪组织一块。术后大鼠活动正常，可自行饮水摄食。

2.3 给药

造模1周后分别给药，假手术组和模型组灌胃等量水，甘草附子汤组灌胃甘草附子汤，高剂量组2.86mL/g，低剂量组1.43mL/g，雌激素组给予苯甲酸雌二醇肌注1.5mg/kg，3次/周，共12周。

2.4 观察指标

2.4.1 骨形态学指标的测定取右侧股骨放入10%甲醛溶液中固定24 h以上，EDTA脱钙，HE染色，制作病理学切片，在光镜下观察骨小梁的变化并摄像。

2.4.2 骨生化指标的测定PICP和ICTP采用酶联免疫吸附法按试剂盒说明进行测定。

2.4.3 分子生物学指标的测定免疫组化法测定Cath K和ColⅠ蛋白。

2.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计处理，所有数据均用(±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD法进行显著性检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠骨组织形态学观察

结果见图1。假手术组大鼠股骨远端骨小梁数目较多，厚度较均匀，形成立体的网状结构(图1A)。模型组与假手术组比较，大鼠骨小梁数目明显减少、变细、厚薄不均，间距增大，形状各异，立体网状结构受到破坏，骨髓腔扩大，部分区域可见大量的脂肪细胞(图1B)。甘草附子汤高剂量组骨小梁网状结构基本恢复。甘草附子汤低剂量组、高剂量组、雌激素组与模型组相比，骨小梁数目有所增多，但低剂量组不如高剂量组明显。

图1 为甘草附子汤对各组大鼠的骨小梁影响Fig.1 The influence of Gancaofuzi Decoction on bone trabeculae

3.2 甘草附子汤对ColⅠ蛋白表达的影响

结果见表1。ColⅠ蛋白主要表达在成骨细胞胞浆及细胞间质，阳性染色为棕黄色或深棕黄色纤维状或颗粒状。在骨细胞胞浆中亦有少量表达。光镜下观察各组照片可以发现，甘草附子汤高、低剂量组、雌激素组和假手术组蛋白阳性。与假手术组相比，模型组大鼠皮质骨及骨小梁中染色较浅，甘草附子汤高剂量组、低剂量组、雌激素组的灰度比模型组有所增加。

3.3 甘草附子汤对Cath K蛋白表达的影响

结果见表1。Cath K蛋白主要表达在骨小梁周围的破骨细胞胞浆中，成骨细胞周围亦可见到少量阳性颗粒，阳性染色为棕黄色。光镜下观察各组照片可见，Cath K蛋白的表达在模型组比假手术组明显增多，比甘草附子汤组和雌激素组显著减少。

表1 各组的免疫组化染色的平均IOD值(×103)(±s)Tab.1 Group immunohistochemical stains average IOD values(×103)((±s)

表1 各组的免疫组化染色的平均IOD值(×103)(±s)Tab.1 Group immunohistochemical stains average IOD values(×103)((±s)

与模型组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.01;与假手术组比较:3 P＜0.01Compared with model group:1 P＜0.05，2 P＜0.01;Compared with normal control group:3P＜0.01

组 别 ColⅠCath K假手术组26.7±3.0 18.7±3.8模型组 16.6±4.53 78.9±5.03中药高剂量组 24.9±3.92 23.8±3.41中药低剂量组 21.2±4.01 21.3±3.3雌激素组 25.4±3.02 22.5±3.72

免疫组织化学染色结果采用Image Pro Plus4.1图像分析系统进行分析，每张片子选取不重叠的5个视野，计算阳性区域的积分光密度(integra optical density，IOD)计算其平均值。

3.4 PICP和ICTP

结果见表2。治疗3个月后，甘草附子汤高剂量组和雌激素组血清PICP与模型组比较，显著升高(P＜0.05);甘草附子汤高剂量组和雌激素组血清ICTP水平与模型组比较，显著下降(P＜0.05);甘草附子汤高剂量组与雌激素组比较没有显著差异(P＞0.05)。而甘草附子汤低剂量组与模型组差异不显著。

4 讨论

表2 各组大鼠PICP，ICTP表达(±s，n=8)Tab.2 Each rat，PICP ICTP expression(±s，n=8)

表2 各组大鼠PICP，ICTP表达(±s，n=8)Tab.2 Each rat，PICP ICTP expression(±s，n=8)

与模型组比较:1 P＜0.05;与假手术组比较:2 P＜0.05Compared with model group:1 P＜0.05;Compared with normal control group:2 P＜0.05

组 别 PICP/(μg/L) ICTP/(μg/L)假手术组79.890±16.547 2.924±0.351模型组 77.660±9.6782 3.478±0.2972中药高剂量组 94.437±12.4381 3.194±0.4031中药低剂量组 83.875±13.506 3.032±0.391雌激素组 95.538±15.7841 3.300±0.4281

传统中医认为“肾主骨，生髓”，所以研究抗骨质疏松药物多从补肾药物着手［5-6］，在大量临床实践中，结合中医“肾为先天之本，脾为后天之本”“脾肾同治”，提出温肾壮骨，健脾益气为治则。治疗绝经后骨质疏松，疗效显著。故选取此方为治疗绝经后骨质疏松的老方新用。

现代药理研究表明，甘草附子汤中附子、桂枝与甘草有抗炎作用。在PMOP中TNF-α及IL-2的炎性因子通过刺激软骨细胞和破骨细胞减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解并产生胶原酶原和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨质疏松。附子，主要成分是生物碱等物质，主要抗炎成分是乌头碱、新乌头碱和次乌头碱，其抗炎机制可能与中枢和组织中的前列腺素有关［7］。甘草，目前已分离100多种黄酮类化合物、18种氨基酸、香豆素及多种生物碱［8］，甘草酸单铵盐对小鼠的炎性因子TNF-α及前列腺素具有明显的抑制作用。白术主要含内酯类、挥发油类和多糖类物质［9］，可降低关节液中 TNF-α、NO的生成来抑制炎症的反应。桂枝主要成分为挥发油，其中主要桂皮醇，主要通过抑制关节液中炎性细胞因子PGE2的活性和炎性介质的含量，来发挥作用［10］。因此，甘草附子汤通过降低炎性因子TNF-α及IL-2，防止破骨细胞生成，从而减少骨浸蚀和骨破坏，降低骨质疏松的发病率。

成骨细胞增殖阶段基因表达的ColⅠ是人体最丰富的胶原类型，约占骨基质的80%～90%，它是构成骨的重要成分［11-12］。ColⅠ在合成纤维过程中，在特定蛋白的作用下水解形成PICP并进入血液，因此，血中PICP水平反映了胶原合成速率成骨细胞的活性和胶原合成速率［13-15］。ColⅠ降解时，释放一种成熟的也是唯一的一种交联物ICIP［16-17］，它以完整的免疫原性蛋白形式进入血液中，其与ColⅠ降解的比例为1∶1。因此，血清中ICTP是反映骨吸收高度敏感的特异性指标。所以，联合检测血清中PICP和ICTP的水平直接反映了骨Ⅰ型胶原合成和降解状态［18］。本实验中，甘草附子汤组血清中的PICP水平显著高于模型组(P＜0.05)，甘草附子汤高剂量组较低剂量组更为显著，而对于ICTP，甘草附子汤组血清中的含量显著低于模型组(P＜0.05)。可见，甘草附子汤可以促进骨形成，同时抑制了骨吸收，对去卵巢大鼠所致骨质疏松有重要的防治作用。

Cath K是破骨细胞分泌的一种溶酶体酶，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量丰富的ColⅠ。Cath K通过作用于ColⅠ蛋白的N端及C端三股螺旋处而降解骨纤维胶质，它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种金属蛋白酶(MMPs)，是骨吸收过程中的一个关键酶［20-21］。在本实验中，模型组的Cath K活性明显提高，甘草附子汤组及雌激素组Cath K活性明显降低，其中甘草附子汤高剂量组与雌激素组无明显差异。

综上所述，甘草附子汤通过下调破骨细胞Cath K的表达来抑制去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞ColⅠ蛋白的降解，增加骨小梁的数量，改善骨小梁的结构，减低骨的转换率，从而达到甘草附子汤对绝经后骨质疏松预防的目的。

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