银翘解毒液超快速液相色谱指纹图谱研究

王延博，孙佳明，李 娜，李 航，张 辉

(长春中医药大学 1.现代教育技术中心，2.中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117)

银翘解毒口服液系由银翘解毒丸等药典收载品种改制而来，制剂处方由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草等组成，具有疏风解表，清热解毒的功效，用于风热感冒，症见发热头痛，咳嗽口于，咽喉疼痛［1］。文献多采用测定处方中的君药中的有效成分绿原酸的含量，来评价其质量优劣［2-3］。建立全面、系统地控制银翘解毒液质量的分析方法十分必要。本文采用二元梯度洗脱模式，建立了完整的银翘解毒液超快速液相色谱(UFLC)指纹图谱分析和评价质量的方法，并对不同批次银翘解毒液的质量进行评价，为其整体控制和评价内在质量提供依据。

1 仪器与试药

UFLC-20AD超快速液相色谱仪、PAD检测器MB20A、LCsolution色谱工作站，日本岛津公司。

绿原酸对照品(批号:753-201010，供含量测定用)，中国药品生物制品鉴定所;银翘解毒液(批号:100521，100625，100712，100728，100815，100821，109014，100918，101021，101025)，哈药集团中药二厂;甲醇(色谱纯)，天津市光复精细化工研究所;水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取银翘解毒液10mL，60℃减压蒸干，精密称取粉末 30.0mg，加50%甲醇 12mL，超声 30 min，10 000 r/min离心15 min，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

称取绿原酸对照品适量，用50%甲醇溶解，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB C18(100 mm×4.6 mm，2.2μm)。流动相A为甲醇，流动相 B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱:0～10 min，A相保持10%;10～20 min A相10%→15%;20～25 min，A相15%→25%;25～30 min，A 相 25%→33%;30～40 min，A相保持33%;40～50 min，A相33%→45%。流速为0.5mL/min，检测波长为280 nm，柱温30 ℃，进样量10μL。

2.4 稳定性试验

取供试品(批号100521)溶液，分别在0，2，4，8，12 h进行检测，考察各主要色谱峰与内参峰保留时间的一致性，各主要色谱峰相对保留时间稳定，各主要色谱峰的相对峰面积比值的RSD不超过5%，表明样品在12 h内稳定。

2.5 精密度试验

取供试品(批号100521)溶液，连续进样6次，考察各主要色谱峰与内参峰相对保留时间和相对面积的一致性，结果各主要峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD不超过5%，表明进样与仪器的精密度良好。

2.6 重现性试验

取供试品(批号100521)3份，同法检测，考察各主要色谱峰与内参比峰相对保留时间和相对面积的一致性，结果各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD不超过5%，表明方法重复性较好。

2.7 UFLC指纹图谱的建立

按2.2项方法制备样品，在2.3项的实验条件下，对10批银翘解毒液的UFLC色谱图进行了分析，确定了16个共有峰(见图1～2)，建立了银翘解毒液的UFLC指纹图谱。以绿原酸(峰5)作为参照物，其保留时间和峰面积分别定为1.00，16个共有峰的相对保留时间(10批样品±s)分别为0.408±0.002，0.525± 0.001，0.603± 0.001，0.873±0.001，1，1.293± 0.001，1.695± 0.002，2.022±0.003，2.039± 0.003，2.097± 0.005，2.164±0.008，2.701± 0.024，2.781± 0.023，2.845±0.020，2.933± 0.022，3.004± 0.020;相对峰面积(10批样品，±s)分别为1.200±0.027，0.120±0.004，0.231± 0.007，0.055± 0.005，1，0.903±0.018，1.972± 0.092，0.221± 0.015，0.202±0.020，0.500± 0.009，0.095± 0.004，4.387±0.068，0.158± 0.014，0.290± 0.013，0.522±0.011，0.050±0.003。

图1 银翘解毒液UFLC对照指纹图谱Fig.1 UFLC reference fingerprint of the Yinqiao Jiedu Oral Liquid

图2 绿原酸对照品UFLC图Fig.2 UFLCfingerprint of chlorogenic acid

2.8 UFLC指纹图谱相似度评价

将10个不同批次的银翘解毒液制成供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，记录UFLC色谱图(图3)，并将图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版1.0版》软件进行处理，得到标准指纹图谱［4］。10批银翘解毒液的UFLC色谱图的相似度分别为0.953，0.983，0.972，0.959，0.987，0.945，0.991，0.995，0.942 和0.962，均大于0.9，基本符合中国药典中药质量标准研究制定技术要求，所建立的银翘解毒液UFLC对照指纹图谱可作为银翘解毒液的标准图谱。

3 讨论

目前对于银翘解毒液的含量测定主要集中在HPLC法测定绿原酸，但其分析时间长，分离效果差。UFLC是日本岛津公司近几年推出的新型液相色谱仪，其采用特殊技术，使得分析时间大为缩短，可以有效的节省溶剂量［5］。

经多次摸索，以梯度洗脱模式50 min内获得银翘解毒液指纹图谱，图谱指纹性强，且各色谱峰大部分都得到了基线分离。

采用二极管阵列检测器做全波长扫描，考察不同吸收波长图谱，重点考察了210，230，254，280和330 nm处的谱图特征。结果表明280 nm波长处各成分具有较好的紫外吸收，色谱信息最为丰富，基线平稳。

实验过程中对其甲醇、含水甲醇和水的提取物分别进行考察，结果50%甲醇提取物出峰较好，故实验中样品均采用50%甲醇提取。同时提取时对样品分别超声处理和加热回流处理，结果表明，以50%甲醇超声提取，出峰最好，色素干扰少，故实验中采用口服液蒸干后取适量50%甲醇超声30 min。

目前对于银翘解毒液的质量控制，主要针对绿原酸和连翘苷的含量，不能全面反映银翘解毒液的质量，本文建立了银翘解毒液UFLC指纹图谱的检测方法，得到的指纹图谱各色谱峰分离度较好，且该方法简便、准确、重现性好，可为银翘解毒液的全面质量控制提供参考。

图3 10批银翘解毒液的UFLC指纹图谱(检测波长:280 nm)Fig.3 UFLC reference fingerprint of 10 batchs Yinqiao Jiedu Oral Liquid(wavelength:280 nm)

［1］中国药典［S］.一部.2010:1086.

［2］湛文青，李 虹.HPLC法测定银翘解毒液中绿原酸含量［J］.广东药学，2004，14(1):11-13.

［3］钟镜金，陈丰连，王术玲，等.HPLC法测定银翘解毒口服液中绿原酸的含量［J］.中药新药与临床药理，2007，18(3):228-229.

［4］王婷婷，陈晓辉，胡庆庆，等.白芷质量的HPLC指纹图谱评价方法［J］.药学学报，2006，41(8):747-751.

［5］施 法，侯 峰.金银花中3种成分含量的超高速液相色谱法同时测定［J］.时珍国医国药，2010，21(11):3014-3015.