响应面法优化水飞蓟粕蛋白的提取工艺

朱淑云，董 英

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

响应面法优化水飞蓟粕蛋白的提取工艺

朱淑云，董 英

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

在pH、液料比、温度及提取时间4个单因素实验的基础上，应用响应面分析法确定了提取水飞蓟粕蛋白的最佳工艺条件。结果表明，用碱提酸沉法提取水飞蓟粕蛋白的最佳条件是：pH11，液料比16∶1，温度50℃，提取时间60min，在此条件下蛋白的提取率为54.52%。

水飞蓟粕，蛋白，提取工艺，响应面法

水飞蓟 silibum marianum（L.）Gaertn（milk thistle），又名水飞雉、乳雉子，为菊科水飞蓟属草本植物，以果实入药，果实中有较大利用价值的成分主要是水飞蓟素、水飞蓟油和水飞蓟蛋白。其中的水飞蓟素具有保肝、抗氧化、抗血小板聚集和抑制癌细胞增值等生理功能［1-4］。水飞蓟素主要分布于种壳中，种仁中含量极微［5］，目前国内对水飞蓟资源的利用主要还是以提取水飞蓟素为主，对种籽中油和蛋白的提取利用为辅，一般剩下的饼粕直接作为饲料或肥料利用，其中的营养成分没有得到很好的利用。研究证明水飞蓟粕中蛋白含量较高，氨基酸种类齐全，是一种很好的植物蛋白源［6］。本工作拟对影响水飞蓟粕蛋白提取率的主要工艺参数进行单因素实验，并以蛋白提取率为指标，采用响应面法对蛋白的提取条件进行优化实验，以期为水飞蓟的综合开发和合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水飞蓟种仁 由江苏中兴药业有限公司提供，经过低温加压溶剂萃取技术脱脂，然后将脱脂水飞蓟粕进行粉碎过80目筛。

加压溶剂萃取装置 江南集团与江苏大学联合研制；FC-160型锤式粉碎机 上海中药机械厂；UNICO WFJ7200可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；ALPHAI-4/2-4型冷冻干燥机 德国CHRIST公司；BS110S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统公司；LD5-2A型离心机 北京医用离心机厂；pHS-3TC型pH计 上海天达仪器有限公司；SHZ-10组合式水浴摇床 太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 水飞蓟粕蛋白提取工艺 脱脂水飞蓟粕→以一定的液料比加水→调节pH→水浴（过程中控制一定的温度和时间，并用NaOH调节pH）→3800r/min离心20min→收集上清液→调节pH5.5→3800r/min离心20min→倾去上清液→真空冷冻干燥→测定蛋白含量

1.2.2 主要成分测定方法 水分含量：105℃恒重法；粗蛋白：凯氏定氮法；粗脂肪：索氏抽提法；总糖：硫酸-苯酚法［7］；灰分：高温灼烧法；蛋白质含量测定：考马斯亮蓝比色法［8］。

1.2.3 蛋白质提取率的计算方法：

1.2.4 水飞蓟粕蛋白提取实验 以水飞蓟粕蛋白提取率为指标，分别研究了pH、提取时间、温度、液料比对蛋白提取率的影响。在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以水飞蓟粕蛋白的提取率为响应值，选取液料比、pH、温度这三个主要因素为自变量，设计三因素三水平RSM表，实验因素与水平如表1所示。

表1 RSM实验设计的因素及水平

1.2.5 pH对水飞蓟蛋白沉淀率的影响［9］将提取的水飞蓟粕蛋白溶液分装到10支离心管中，分别用HCl调至不同的pH，静置30min，然后经4000r/min离心15min，测定上清液中蛋白质的含量，利用以下公式计算水飞蓟蛋白的沉淀率：

沉淀率（%）=酸沉淀前上清液中蛋白质的含量-酸沉后上清液中蛋白质的含量/酸沉前上清液中蛋白质的含量×100%

2 结果与讨论

2.1 水飞蓟粕蛋白提取的单因素实验

2.1.1 pH对水飞蓟粕蛋白提取率的影响 由图1可知，pH在7～10之间时，提取率随着pH的升高而提高，且提高幅度较大；pH达到10后，提取率增加缓慢。从实际生产考虑，提取水飞蓟粕蛋白的pH在10左右较好，这样一方面减少了加碱加酸量，降低了成本；另一方面，考虑到pH过高会引起蛋白质变性，因此要限制体系的pH。

图1 pH对水飞蓟粕蛋白提取率的影响

2.1.2 液料比对水飞蓟粕蛋白提取率的影响 由图2可知，随着液料比的增大，提取率逐渐增加，当液料比为16∶1时，提取效果达到最佳，当料液继续增大时，提取率略有下降，可能是由于有蛋白酶溶出，分解了部分蛋白质，因此选定提取水飞蓟粕蛋白的液料比为16∶1。

图2 液料比对水飞蓟粕蛋白提取率的影响

2.1.3 温度对水飞蓟粕蛋白提取率的影响 由图3可知，伴随着温度的升高，提取率也在不断地提高，在30～40℃之间，提取率的增长速度较快，当温度达到40℃后，提取率增长缓慢。考虑到温度过高会导致蛋白质变性，故选定提取水飞蓟粕蛋白的温度为40℃。

图3 温度对水飞蓟粕蛋白提取率的影响

2.1.4 时间对水飞蓟粕蛋白提取率的影响 由图4可知，当提取时间比较短时，蛋白溶解得不充分，故提取率较低，当提取时间达到60min后，延长提取时间对蛋白的提取率影响并不大，因此选定蛋白的提取时间为60min即可。

图4 时间对水飞蓟粕蛋白提取率的影响

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面（RSM）设计及结果 根据3因素3水平的响应面实验设计，共设立了15个实验点，其中12个为析因点，3个为零点。零点实验进行3次，以估计误差。实验方案及结果见表2。

表2 响应面设计实验方案及结果

2.2.2 响应面分析与优化 RSM程序通过对各因素值和响应值分析计算，说明响应值与各因素值之间不是简单的线性关系，进一步对回归模型进行分析，其系数显著性结果如表3。

表3 方差分析表

从表3中可以看出，模型是高度显著的（P＜0.01），失拟误差不显著（P＞0.05），回归方程的相关系数R2为0.9788，校正后的R2为0.9406，这说明实验误差小，变量与自变量之间的模型关系显著，回归方程与实际情况拟合良好，所以该实验设计是可靠的。数据分析结果表明，pH、温度和液料比对水飞蓟粕蛋白提取率具有极显著的影响，但各因素之间的交互作用不显著。

2.2.3 最优提取工艺参数的确定及验证 综合考虑各种因素的相互作用，根据实验结果和二次多项回归方程，利用Design Expert 7.0软件分析得到了水飞蓟粕蛋白提取率最高时的工艺条件为：pH11，液料比16.18∶1，温度49.6℃，在此条件下蛋白的提取率为55.06%。考虑到实际生产情况，将最佳条件修正为pH11，液料比16∶1，温度50℃，在此条件下进行三次实验，平均值为54.52%。与理论值接近，说明采用RSM法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

2.3 pH对水飞蓟粕蛋白沉淀率的影响

图5 pH对水飞蓟粕蛋白沉淀率的影响

由图5可知，水飞蓟粕蛋白的沉淀率随pH的增加呈先增加后降低的趋势，在pH为5.5左右时的沉淀率最高，因此我们选用蛋白质酸沉淀时的pH为5.5。

2.4 水飞蓟粕及提取蛋白的主要组分分析

对脱脂后的水飞蓟粕和所提取的蛋白进行成分测定，结果如表4所示。由表可见，水飞蓟粕中蛋白质含量较高，具有较高的利用价值。蛋白提取液经冷冻干燥得到的蛋白粉，其蛋白含量为84.53%。提取的蛋白达到了分离蛋白的含量水平，可以作为优质蛋白利用。

表4 水飞蓟粕及提取蛋白的各组分含量（%）

3 结论

本研究结合所筛选的关键因素利用响应面实验设计，拟合了pH、液料比、温度与水飞蓟蛋白提取率之间的相互关系，并通过响应面分析，得到了提取水飞蓟粕蛋白的最佳工艺条件：pH11，液料比16∶1，温度50℃，在该条件下蛋白提取率达到54.52%，所提取的蛋白含量为84.53%。

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［5］尚炜，才松，杨彦春.水飞蓟种壳与种子总黄酮含量比较［J］.中国中医科技，1995，2（5）：24-25.

［6］陈毓荃，王春梅，张文.水飞蓟综合利用基础研究Ⅱ果实油脂和蛋白质［J］.西北农业学报，1998，7（1）：79-81.

［7］宋俊英.茶薪菇总糖、还原糖和多糖的测定［J］.中草药，2006，37（9）：1421-1422.

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Optimized technology for extracting milk thistle cake protein by response surface methodology

ZHU Shu-yun，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Based on single-factor test analysis，the optimum conditions including pH，liquid-solid ratio，temperature and extraction time of milk thistle cake protein by alkaline extraction and acid precipitation were determined through response surface methodology.The condition were as follows：pH11，liquid-solid ratio16∶1，temperature50℃and extraction time 1h.The protein extraction rate was 54.52%under the condition.

milk thistle cake；protein；extraction technology；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0256-03

2010-01-26

朱淑云（1975-），女，讲师，在读博士，研究方向：食品科学。

江苏大学高级人才科研启动基金项目（09JDG027）。