耐高糖度枸杞酒酵母菌的选育

贺晓光，辛世华，方海田

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

耐高糖度枸杞酒酵母菌的选育

贺晓光，辛世华，方海田

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

以自然选育的酵母菌为出发菌，对其进行紫外辐照诱变育种，从中选育出在较高的糖浓度下发酵良好的菌株，结果表明最佳诱变条件是：稀释率为10-6，辐照距离d=15cm，辐照时间t=30s，该诱变菌在30%的初始糖浓度下生长良好，在温度20～22℃条件下的鲜枸杞汁中发酵，产酒产香效果好。

枸杞酒酵母，高糖分离，诱变选育，紫外辐照

枸杞作为中药药用历史悠久，现代科学研究证明枸杞有效成分为枸杞多糖，枸杞多糖具有激活T细胞，调节机体免疫，抑制小鼠S-180肿瘤，抗衰老，促进生长发育等多项机能［1］。以枸杞为原料酿造的枸杞酒含有枸杞诸多营养成分，它以诱人的色泽、独特的口感、卓越的保健功效，填补了葡萄酒市场功能单一的缺憾［2］，枸杞酒的造法主要有浸泡法和酿造法两种。目前市场上主要为浸泡酒，枸杞发酵酒的研究还少见［3］。生产中，酵母发酵采用多次补糖法以提高发酵效率，根据实际经验，当枸杞汁的初始糖浓度达到30%时，枸杞酵母发酵周期明显变长，口感下降，发酵效果差。目前对于枸杞酵母的研究还很少见，所以选育出一株耐高糖度的酵母菌可以提高生产效率，减少生产环节中的污染可能，为枸杞酒的生产提供了新的菌株［4］，减少了生产成本，达到可观的经济效益。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枸杞 宁夏回族自治区中宁县枸杞种植园无公害枸杞；砂糖 一级，市售；PDA培养基、孟加拉红培养基［5］、亚甲基蓝酵母培养基 现配；出发菌株 通过自然分离。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 采摘新鲜无公害枸杞，榨汁后调整成分，将果汁中添加亚硫酸，添加浓度为0.01mol/L，添加量为6%，同时加入葡萄糖，调节糖度为30%，以柠檬酸调节pH=5.6。将调配好的枸杞汁自然发酵24h，将醪液以倾注法培养分离，使用孟加拉红培养基，培养10h后将培养皿中生长旺盛的菌落挑取若干株，接入PDA培养基中，25℃培养12h，分离获得单个菌株生长出的菌落，在电子显微镜下观察菌株形态，选与酵母菌形态相同的菌株，在PDA培养基上划线分离6株，经验证为酵母菌，保存，并标记为：G、H、S、T、X、Y株。

1.2.2 实验流程 自然发酵→筛选→出发菌株→物理诱变（紫外线）→分离正诱变株→发酵实验→性能测定

1.2.3 出发菌的酒精发酵实验 对分离出的6株菌株进行模拟发酵实验，观察菌株的产酒率。将6株菌株分别接种到调整好的枸杞汁中25℃下恒温发酵，一周后停止发酵，测酒精度，从中选出三株（X、S、G）产酒高、反应快的菌作为诱变出发菌。

1.2.5 诱变菌株的耐糖度实验 对辐照诱变得到的6株酵母菌进行耐糖度实验，选取5个枸杞汁浓度梯度，糖度从30%至50%，在20℃下进行恒温发酵，绘制生长曲线，观察菌株的生长情况，结束时测定酒精度，比较在不同糖浓度下的生长情况和酒精转化率，记录数据，保存正向辐照诱变菌株。

2 结果与分析

2.1 出发菌株悬液浓度的选择

菌悬液的浓度大小对辐照实验有很大影响。从培养基上挑取标准菌落溶于10mL，7%的NaCl无菌溶液中，制成原始菌种溶液，进行稀释制成稀释度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的5种菌体悬浊液，在同一条件下进行辐照诱变（15W紫光灯，距离为15cm，时间为45s）。各组稀释率下的致死率（见表1），确定稀释率为10-6为最佳［6］。

表1 不同稀释度对诱变的影响

2.2 辐照时间的确定

取标准菌株进行单因素实验，挑取每个菌落，均用7%无菌食盐溶液1mL溶解，在紫光灯下辐照，取相同距离，然后用倾倒法培养24h，观察生长出来的菌落数［7］；同样方法，取30s辐照时间，取不同距离，观察生长出的菌落数，以标准菌株生长出的菌落数为参照。

辐照实验过程要进行避光处理，辐照结束后应保持无光状态1h，辐照时还应注意温度变化，温度应保持恒定，不易变化过大，影响结果。单因素实验结果如图1所示，确定最佳辐照时间t=30s。

图1 不同辐照时间产生菌落数

根据辐照后观察菌落数的个数在30s时，曲线出现最大斜率［8］，故选择辐照时间为30s。

2.3 照射距离的确定

根据辐照诱变的基本要求，控制致死率在50%左右，从而筛选正向诱变耐高糖度的酵母菌，最终确定辐照时间为30s，辐照距离为15cm［9］。（见图2）

由以上实验，确定辐照实验单因素条件为：稀释率为10-6为最佳，最佳辐照距离d=15cm，辐照时间t =30s，在最佳条件下，对已诱变的菌株进行分离，三代后能正常生长，不衰退即为诱变稳定株，为：X-Ⅰ型，X-Ⅱ型，S-Ⅰ型，S-Ⅱ型，S-Ⅲ型，G-Ⅰ型六种亚型。

2.4 不同糖度下诱变菌株生长的影响

选取5个枸杞汁浓度梯度，糖度从30%至50%，对已分离的六种亚型菌株进行培养，在25℃下进行恒温培养，48h后观察菌落生长情况［10］。结果见表2。

图2 不同距离对致死率的影响

表2 不同糖浓度下菌株在固体培养基上的生长情况

由表2看出，通过对辐照诱变得到的6株酵母菌进行耐糖度实验，在 25℃下进行恒温培养［11］，在30%的糖度下6个菌株均能生长，而超过糖浓度35%，渗透压增大，菌体不能正常代谢［12］。

2.5 生长速度曲线

使用调整好成分的枸杞汁使糖度保持在35%，分装后接入分离后的6株菌，发酵48h，24h后每隔4h使用分光光度计，绘制菌种生长曲线［13］。

图3 35%糖浓度下不同酵母的生长曲线

由图3生长曲线可知，S-Ⅱ型酵母菌在高糖浓度枸杞汁条件下，能正常发酵生长。

2.6 产酒情况

在35%的糖度下发酵72h后，每8h测定一次酒精度，做6个菌株的酒精曲线，S-Ⅱ型酵母菌产酒曲线最高，最后得出此菌为辐照诱变目的菌株［14］。

图4 六种不同酵母产酒精曲线

根据上图连续曲线观察可知S-Ⅱ型酵母菌在高糖浓度条件下产酒精效果最佳。

3 结论

通过对本实验自然分离的酵母进行紫外照射诱变处理，诱变选育出S-Ⅱ型菌株的耐糖度可高达35%以上，产酒精速度快。研究中采用的紫外诱变的条件为稀释率为10-6为最佳，最佳辐照距离d= 15cm，辐照时间t=30s，所得诱变株的耐糖度高于分离发酵菌株，有效地提高了菌株的生产酒精效率，是一株很有开发前景的酿酒酵母菌。

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Breeding of Lycium barbarum’s yeast with high-sugar resistance

HE Xiao-guang，XI Shi-hua，FANG Hai-tian
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

A high-yield yeast which can fermen（tgrow）well under the high sugar density has been screened and bred by UV mutagenization.The result showed when the yeast was irradiated for 30s with 15cm away from it under the dilution ratio 10-6，the yeast would grow best.At the same time，when the initial sugar density was 30%and the temperature was 20～22℃，the mutafacient yeast grew best，it would produce the best favor wine.

Lycium barbarum’s yeast；sifting by high concentration ofsugar；mutation breeding；ultraviolet radiation

TS262.91

A

1002-0306（2011）02-0181-03

2010-01-27

贺晓光（1963-），男，教授，主要从事食品物性学研究。