乳酸杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型的条件优化

许飞利，杨晓光，郭云昌，付 萍，王洪新，李志刚，刘秀梅，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京100021）

乳酸杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型的条件优化

许飞利1，杨晓光2，郭云昌2，付 萍2，王洪新1，李志刚2，刘秀梅2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京100021）

目的：通过将脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法应用于乳酸杆菌分型研究，以建立乳酸杆菌PFGE分型的最优方法。方法：针对不同内切酶、酶切浓度、酶切时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的重要因素进行优化，使用优化后的条件对乳酸杆菌22株标准菌株进行分型研究。结果：在乳酸杆菌的PFGE分型研究中，选择AscI为内切酶、酶切浓度为30U/150μL、酶切时间为4.5h、脉冲时间为1～15s为PFGE电泳的最优条件，在所分析的22株乳酸杆菌标准菌株中，5种乳酸杆菌的PFGE图谱各不相同，但种内不同株电泳图谱的区别并不稳定。结论：PFGE方法可用于乳酸杆菌的基因分型研究。

脉冲场凝胶电泳（PFGE），乳酸杆菌，分子分型

乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌，在维持和调节人体内微生态平衡、抑制病原微生物侵袭、防止多种疾病等方面具有举足轻重的作用［1］，在食品工业和医药行业中应用广泛，主要有嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌等。近年来随着分子生物学的发展，有关乳酸杆菌分子生物学方面的研究也越来越受到科学研究者的关注。本实验将细菌分子分型的标准—脉冲场凝胶电泳方法（pulse field gel electrophoresis， PFGE）用于乳酸杆菌的分型研究中，对影响实验结果的相关因素进行了优化分析，初步确定乳酸杆菌PFGE合适的分型条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用乳酸杆菌标准菌株及沙门菌Braenderup参考菌株H9812 均由中国疾病预防控制中心营养与食品安全所食源性疾病监控室提供，所有实验菌株实验前均经过API50CHL生化板鉴定；MRS琼脂、MRS肉汤 OXOID公司；ApaI、SmaI、AscI、XbaI限制性内切酶 NewEngland公司；Tris base、Tris-HCl Promega公司；蛋白酶K Merck公司；SeaKem Gold琼脂糖 Cambrex公司；溶菌酶、SLS（Sodium lauroyl Sarcosine）、SDS（Sodium dodecyl sulfate）、Na2EDTA· 2H2O 均购自美国Sigma公司。

比浊管，bioMérieuxVitek浊度计 bioMérieux公司；50mL screw cap试管 Corning公司；GELDOCXR凝胶成像系统、CHEF-mapper型脉冲场凝胶电泳仪Bio-Rad公司；纯水仪MILLIPORE公司；恒温培养箱（36±1）℃、厌氧培养盒 MITSUBISHI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株DNA的制备提纯 冻干乳酸杆菌种用常规方法进行复苏：使用MRS肉汤溶解菌种，置于厌氧盒中37℃条件下培养48h，接种于MRS琼脂平板，同条件培养48h，选典型菌落转种MRS琼脂平板再次同条件培养，之后取适量菌落制成透光度为13%～14%的菌悬液，取300μL，37℃预热10min后加入30μL溶菌酶（10mg/mL）58℃孵育15min，之后再加入15μL蛋白酶 K（20mg/mL）和300μL溶化的56℃ 1% SeaKemGold：1%SDS琼脂糖混合，加入模具中室温下静置15min；5mLCLB溶液中加入25μL蛋白酶K（20mg/mL）混匀，将凝固成型的胶块放入蛋白酶K/CLB混合液，54℃水浴摇床（约175r/min）孵育2h；弃去CLB50℃洗涤胶块（约150r/min）：超纯水（10min/次）洗胶块2次，再用TE（15min/次）洗胶块4次。

1.2.2 限制性内切酶消化 用刀片切取约2mm宽洗涤后的胶块，置200μL的1×内切酶缓冲液中，25℃（ApaI、SmaI）及37℃（AscI、XbaI）平衡10min，弃去缓冲液，加入150μL的1×内切酶缓冲液和适量的限制性内切酶，25℃及37℃酶切一定时间，弃去缓冲液，加入200μL的0.5×TBE平衡胶块10min。

1.2.3 脉冲场凝胶电泳制备 将酶切后的胶块放置在梳子齿上，将梳子放入胶槽，倒入0.5×TBE配制而成的150mL溶化的1%SKG（SeaKem Gold琼脂糖），制胶。以0.5×TBE为电泳缓冲液，14℃、120°、6V/cm、Linear Ramping Factor条件下电泳。待电泳结束，取出胶，使用 1μg/mL溴化乙锭溶液染色30min，然后用超纯水脱色30min，放入凝胶成像仪照相，记录电泳结果。

1.2.4 脉冲电泳条件优化 选取了ApaI、SmaI、AscI、XbaI 4种限制性内切酶酶切乳酸杆菌，进行电泳，挑选电泳条带数目和大小适中的内切酶，并探索该内切酶的最适酶切浓度和酶切时间，本实验采用了10、30、50、70U/150μL 4个酶切浓度及0.5、2.5、4.5、6.5、8.5h 5种酶切时间，脉冲时间则实验了0.15～15s、1～15s、1～60s 3种方案。

1.2.5 结果分析 获得的脉冲场电泳图谱用BioNumerics数 据 库 软 件（AppliedMathsBVBA，Belgium）进行处理，识别图形条带，进行树状图自动生成。

2 结果与分析

2.1 限制性内切酶的选择

从四种内切酶的PFGE电泳图谱来看，AscI的电泳条带在电泳凝胶上分布均匀，数目也较为适中，条带较清晰，容易辨认，显示出了良好的分型能力。而其余三种酶的电泳条带多集中于凝胶的前部，且条带间间隔不清，未完全分开。因此，AscI是比较合适的内切酶。见图1。

图1 不同内切酶的乳酸杆菌PFGE图谱

2.2 酶切液浓度的选择

从图2可以看出，当酶切浓度为10U/150μL时，电泳条带模糊，难以辨别；当酶切浓度为30、50、70U/150μL时酶切效果均较好，条带相对来说最清楚。因此，30、50、70U/150μL这三种酶切浓度均可选择，可以认为30U/150μL为最佳酶切浓度。

图2 不同酶切浓度的乳酸杆菌PFGE图谱

2.3 酶切时间的选择

从图3的几种酶切时间来看，0.5h的电泳条带很模糊，较难辨认；2.5h的电泳条带稍模糊，可以辨认；4.5、6.5、8.5h的电泳条带均清晰可辨，因此，可以认为4.5h为最合适的酶切时间。

2.4 脉冲时间的选择

从图4可以看出，后两种脉冲时间均可以产生相似且清楚的电泳条带，只是0.15～15s这个脉冲时间的条带稍偏下；1～60s脉冲时间的电泳条带整体过于偏向凝胶的前部，但是仍然较清楚，只是大片段之间距离较远，而小片段又过近。总的来看，分辨率效果最好的是1～15s，其次是0.15～15s。因此，本实验最终选择1～15s作为最佳脉冲时间。

图3 不同酶切时间的乳酸杆菌PFGE图谱

图4 不同脉冲时间的乳酸杆菌PFGE图谱

2.5 乳酸杆菌标准株的PFGE分析

图5是22株乳酸杆菌标准菌株的PFGE图谱，所选内切酶为AscI、酶切时间为4.5h、酶切浓度为30U/150μL、脉冲时间为1～15s。可以看出，同一种乳酸杆菌的PFGE图谱不尽相同，而不同种的乳酸杆菌有的却有相同的图谱。副干酪乳酸杆菌01、07、10、16、18、21中，07、10有相同的图谱，01、18有相同的图谱，而16和21则又各有不同的图谱；两株植物乳杆菌02、03图谱相同；鼠李糖乳酸杆菌04、06、08、11、12、13、14、15、17、19、20、22中，04、06、08、12图谱相同，13、14、19图谱相同，11、15、17、20、22各有不同的图谱；嗜酸乳酸杆菌05与发酵乳酸杆菌09有相同的图谱。纵观全图可以明显看出，04、05、06、07、08、09、10、12图谱相同，而这些菌分属不同的种。

2.6 聚类分析

聚类分析结果图6显示，22株乳酸杆菌标准株的最高相似性为100%，最低相似性为58.6%。在相似性为60.5%水平上，乳酸杆菌22株标准株被聚为3大类，其中鼠李糖乳杆菌13、14、15、17、19、22、04、06、08、12、20，副干酪乳杆菌07、10、16和嗜酸乳杆菌05，发酵乳杆菌09聚为一簇，植物乳杆菌02、03聚为一簇，副干酪乳杆菌01、18、21及鼠李糖乳杆菌11聚为一簇。在相似性为73.4%水平上，乳酸杆菌五种菌基本可被完全区分开。

图5 22株乳酸杆菌标准菌株的PFGE图谱

图6 22株乳酸杆菌标准菌株PFGE图谱聚类分析结果

3 讨论

表型分型方法对反映物种的起源、进化和变异具有一定的局限性。近年来，从基因水平上进行细菌分型的研究越来越多。脉冲场凝胶电泳是用稀有位点的限制性内切酶对细菌染色体DNA进行消化，将染色体切成5～30条大小约为10～800kb的片段，然后在交变脉冲电场的作用下进行电泳，从而将大小不同的DNA片段分离，稳定性好，分辨率高，分型结果不受表型性状的易变性带来的干扰，是目前最理想的分型方法［2-4］。由于使用细菌的原位酶切，酶切位点的突变、基因序列的缺失或插入均会造成的电泳条带的改变，因而可以显示基因组的细微变化，这对了解细菌的遗传特征有重要意义［5］。而要得到理想的分型效果，则必须有合适的电泳条件。

在限制性内切酶的选择方面，应选择电泳条带清楚，条带数目及片段大小适中的酶，因此，本实验选择了AscI作为内切酶。相比来看，其余三种酶则因酶切位点过多而产生了过多的小片段，无法分析。在酶切液浓度的选择上由于有些酶价格昂贵，因此不得不考虑实验成本，所以，以图谱中电泳条带刚好清晰可辨为原则。故本实验选择30U/150μL为最佳酶切浓度。而在酶切时间的选择上，以酶切完全为原则，故本实验选择4.5h作为酶切时间。对于脉冲时间，以图谱中电泳条带清楚、分布均匀不成堆且整体位于凝胶中部为原则，因此本实验选择的脉冲时间为1～15s。

通过选择以上合适的分型条件，本实验比较成功地获得了乳酸杆菌标准菌株的PFGE图谱。这个图谱基本可以区分乳杆菌各种，但种内不同株电泳图谱的区别并不稳定。通过树状图结合系统发生的观点来看，相似率为100%则可以证实这些菌株来源于相同的祖先。其中，相似率为100%菌株数最多的一簇中，既包括鼠李糖乳杆菌，又包括嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌，说明这些菌株在由同一祖先进化的过程中，可能产生了不同程度的变异而表现出不同的表型特征，从而从属于不同的种。

总之，AscI酶切的乳酸杆菌标准株的PFGE指纹图谱，可以在种水平区分各标准株，而且在一定程度上反映了各菌株间的遗传进化关系，是一种较为理想的分型方法。但目前关于这方面的研究仍然很少，还需要做大量的工作，才能更进一步地进行综合分析，也才可以为乳酸杆菌在食品医药中的安全应用提供可靠的理论依据。

［1］Cross ML.Immune-signalling by orally delivered probiotic bacteria：effectson common mucosalimmunoresponsesand protection at distal mucosal sites［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2004，17：127-134.

［2］Tsen HY，Lin JS，Hu HH，et al.Use of pulsed field gel electrophoresis as an epide miological tool for analysis of sporadic ociated strains of Salmonella typhi isolated in Taiwan［J］.J Appl Microbiol，1999，86（5）：761-768.

［3］Mirza S，Kariuki S，Mamun KZ，et al.Analysis of plasmid and chromosomal DNA of multidrug-resistant Salmonella entorica sevoval typhi from Asia［J］.J Clin Microbiol，2000，38（4）：1449-1452.

［4］Ogle JW，Michael JJ，Woods DE，et al.Characterization and use of a DNA probe as an epidemiological maker for Pseudomonas aeruginosa［J］.J Infect Dis，1987，155（1）：119-126.

［5］Anand R.Pulsed field gel electrophoresis：A technique for fractionating large DNA molecules［J］.Trends genet，1986，2：278-283.

Optimization in molecular typing of Lactobacillus by pulsed field gel electrophoresis

XU Fei-li1，YANG Xiao-guang2，GUO Yun-chang2，FU Ping2，WANG Hong-xin1，LI Zhi-gang2，LIU Xiu-mei2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Institute for Nutrition and Food Safety，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021，China）

Objective：A method of molecular typing of Lactobacillus was established and optimized by pulsed field gel electrophoresis（PFGE）.Methods：PFGE was used in the genetic typing study of Lactobacillus to optimize the factors influencing the typing of PFGE including different restriction endonuclease，different reaction concentration and reaction time.With these optimized factors，typing research was conducted to the 22 reference strains of Lactobacillus.Results：Restriction endonucleases Ascl was selected in this study with the optimized condition to be reaction concentration of 30U/150μL，reaction time of 4.5 hours and pulse time of 1～15s.By this technique，five electrophoretypes were distinguished in five reference strains of the different species，but the Lactobacillus within a species could not be distinguished by the PFGE.Conclusion：PFGE could be used to classify and identify Lactobacillus.

pulsed field gel electrophoresis（PFGE）；Lactobacillus；molecular typing

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0178-04

2010-08-09 *通讯联系人

许飞利（1979-），女，博士研究生，研究方向：食品营养与安全。

转基因生物新品种培育重大专项（2008ZX08011-005）。