气相色谱法测定牛奶中二嗪农残留量

敖 然，曾振灵，余静贤，沈祥广

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642）

二嗪农是少数允许在兽医上使用的有机磷农药中的一种.在畜牧业上，二嗪农主要用于防治牛、羊、猪的螨、蝇、虱、蜱等体外寄生虫病.我国和欧盟对二嗪农在奶中规定了停药期(弃奶期3 d)和最大残留限量(MRLs 20 μg·kg－1).目前，国内用于监测二嗪农残留的检测方法主要集中在蔬菜、水果、肉食品等方面，检测牛奶中二嗪农残留的文献报道较少，尚未有专门用于测定奶中二嗪农残留的国家标准或行业标准.国内外有机磷农药残留的检测方法主要有液相色谱 － 质谱联用法［1］、薄层色谱法［2］、气相色谱法［3］、气相色谱 － 质谱联用法［4］等.采用气相色谱法结合火焰光度检测器(FPD)具有特异性强、灵敏度高的特点.此外气相色谱仪的仪器价位较低，几乎在全国各级农产品监测机构和奶业企业均已普及.牛奶是一种比较理想的完全营养食品，已经成为大众饮食中不可缺少的一部分，它的安全和品质关系到广大民众的身体健康.该方法的建立将有利于奶业企业对原料奶的采购和产品的生产过程进行在线检测，也有利于基层农产品监测机构就近对奶业企业及市场奶品的产品质量安全进行有效监督.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

二嗪农标准品(德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号:C12210000，纯度97.5%);乙腈、丙酮、正己烷均为国产分析纯;中性氧化铝固相萃取柱.

1.2 仪器

Autosystem XL GC气相色谱仪，配火焰光度检测器(FPD)为美国Perkin-Elmer公司产品;J-25型冷冻高速离心机为德国Baeckman公司产品;旋转蒸发仪;氮吹仪;KS501 digital轨道式摇床为德国 Hettich公司产品;分析天平(感量0.00001 g).

1.3 试液配制

二嗪农标准贮备液:准确称取0.01026 g二嗪农标准品至100 mL容量瓶，用丙酮定容成为100 mg·L－1的二嗪农标准贮备液.

二嗪农标准溶液:根据需要精密吸取二嗪农标准贮备液适量，用丙酮稀释成质量浓度分别为20、50、100、500、1000、2000 μg·L－1的标准溶液.

1.4 色谱条件

色谱柱:DB-17石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm).不分流进样.柱温程序:初始温度100℃，保持5 min，以 30℃·min－1升至 260℃，保持 6 min;进样口温度250℃;检测器温度 250℃;载气(氮气，纯度≥ 99.999%)2.5 mL·min－1;燃气(氢气)70 mL·min－1;助燃气(空气)100 mL·min－1;进样量 2 μL.

1.5 样品的处理

1.5.1 样品的提取 称取牛奶10 g(精确至0.01 g)，置于 50 mL聚丙烯塑料离心管中，加丙酮 10 mL，摇匀，加入正己烷20 mL，盖紧，置摇床振荡 20 min，8000 r·min－1离心 10 min，上清液移入梨形瓶中，再往离心管中加入20 mL正己烷，重复上述提取步骤，上清液并入同一梨形瓶中，50℃减压蒸干.

1.5.2 样品的净化 取中性氧化铝固相萃取柱，加5 mL乙腈平衡，抽干;用5 mL乙腈涡旋溶解梨形瓶蒸干后的残留物，过柱，加2 mL乙腈洗柱，抽干，收集过柱液和洗柱液于10 mL玻璃的离心管中，置50℃水浴中用氮气吹干，用1 mL丙酮溶解吹干残留物，进气相色谱仪分析.

1.5.3 标准曲线制备 二嗪农基质匹配标准溶液:移取相应质量浓度下的二嗪农标准溶液1 mL溶解空白牛奶样品处理后的残留物，制得该质量浓度下的二嗪农基质匹配标准溶液，进气相色谱仪分析.

2 结果与分析

2.1 牛奶中二嗪农的线性关系

取适量相应浓度二嗪农基质匹配标准工作溶液，在“1.4”所述色谱条件下，二嗪农保留时间约9.8 min.以二嗪农的浓度对峰面积作线性回归，线性方程为Y=0.015X－1.630，r=0.9999，式中Y表示二嗪农质量浓度(μg·L－1)，X表示相应的峰面积响应值，r表示相关系数.二嗪农基质匹配标准溶液、空白牛奶样品和空白牛奶添加样品的色谱分析结果见图1.

图1 二嗪农基质匹配标准溶液(0.1 μg·mL－1，a)、空白牛奶样品(b)及空白牛奶添加样品(10 μg·kg－1，c)的气相色谱图Fig.1 Chromatogram of diazinon matrix standard solution(0.1 μg·mL －1，a)，blank milk sample(b)and blank milk with diazinon sample(10 μg·kg－1，c)

2.2 检测限

本方法的检测限采用空白牛奶样品添加标准溶液的方法进行实际测试，分别在 2.0、5.0 μg·kg－1水平进行测试，每批每一质量浓度重复测定5次，分别计算二嗪农峰高/噪音(S/N)比值，共进行4批次，结果质量浓度为2.0 μg·kg－1的平均S/N为4.04 ±0.72(n=20);质量浓度为 5.0 μg·kg－1的平均 S/N 为11.4±1.02(n=20).确定了方法中二嗪农检测限为2.0 μg·kg－1(S/N≥ 3)，定量限为 5.0 μg·kg－1(S/N≥10).

2.3 回收率及变异系数

采用空白牛奶样品添加标准溶液的方法进行添加回收率试验，对方法的准确度进行测试.将适量不同质量浓度标准工作液各加入10 g空白牛奶样品中，制得 5、10和 20 μg·kg－13 个添加水平的样品，然后按样品处理方法处理，进行色谱分析.每一批样品均测定5次，共4批样品.二嗪农的回收率及变异系数见表1.

表1 牛奶中二嗪农不同质量浓度的回收率和变异系数Tab.1 Recoveries and RSD of diazinon in milk at different concentrations

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的优化

二嗪农是一种极性相对较小的脂溶性有机磷农药，经试验，采用硫磷检测器(FPD)和中等弱极性的毛细管色谱柱(DB—17型号)进行分析对其具有较好的选择性和灵敏度.检测器温度控制在250℃时，二嗪农的响应峰较高，温度上升，峰高有下降的趋势.在本试验所用柱温程序条件下二嗪农的色谱峰宽较窄，峰形高而对称，空白牛奶试样在二嗪农色谱峰的保留时间附近无杂质峰干扰.进样室温度设置为250℃，有利于被测物质有效气化，同时防止其在进样室蓄积而干扰检测，进样室温度下降或者升高，药物的色谱峰峰高均有下降的趋势.

3.2 样品处理方法的选择

3.2.1 提取与净化 比较了极性较大的有机溶剂(乙腈、丙酮或乙醇等)［5－6］、极性较弱的有机溶剂(正己烷、乙酸乙酯或石油醚等)［7－9］来提取牛奶中的二嗪农.因为正己烷的沸点低，极性弱，提取后携带的杂质少，对提取二嗪农有良好的选择性;同时由于提取后的溶剂含水量很低，易于蒸馏浓缩，最终采用正己烷为提取溶剂.因牛奶中含有乳化成分，容易使正己烷被乳化，所以在10 g牛奶中先加入10 mL丙酮，使蛋白质变性，同时破坏乳化.

牛奶中含有乳脂，用正己烷提取后同时也带入了脂肪，常用液液萃取或固相萃取方法进行净化［10－11］.由于选用正己烷为提取溶剂，不宜采用液液萃取的方法除脂肪，故选用固相萃取法.经对氧化铝柱、C18柱、HLB柱和阳离子交换柱(SCX、MCX)等进行比较，使用1 g规格的中性氧化铝固相萃取柱能较好去除脂肪，操作简便，二嗪农的回收率也较高，使用2 g规格的中性氧化铝固相萃取柱，能更好去除脂肪，但回收率有所下降(约5%).

3.2.2 基质效应 据文献报道，关于有机磷农药在蔬菜、水果、肉类等食品中残留的气相法检测试验中，样品基质对许多有机磷农药色谱峰的响应值有增强效应［12－13］.在试验中发现，同一浓度下，含基质的二嗪农标准溶液的色谱峰面积约是用纯丙酮配制的标准溶液的色谱峰面积的1.5倍.因此，检测结果的计算采用欧盟推荐的基质匹配标准溶液校准法计算［14］，以抵消基质效应对检测结果的干扰.

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