基于分子生物学的大庆油田聚驱后内源微生物资源评价

柏璐璐

( 大庆油田有限责任公司 勘探开发研究院，黑龙江 大庆 163712 )

0 引言

近年来，基因组学和现代分子技术的成熟逐渐渗透到有关生命科学的整个领域，也为微生物生态学提供了新的研究方法和机遇.自1985年Pace等以核酸测序技术研究微生物的生态和进化以来，对微生物的多样性研究进入一个新阶段，并逐步发展形成成型的分子微生物生态学(Molecular Ecological Technology of Microorganisms)方法和技术[1].目前，微生物分子生态学研究的焦点主要集中在具有保守序列的16S rRNA上，研究方法包括16S rRNA序列分析、核酸探针杂交法等.

由于石油资源短缺和勘探费用的不断增加，以及注水采油后几乎有60%～70%的原油留在油藏中，使得三次采油方法日益受到广泛重视.其中，微生物提高原油采收率技术(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)是最有希望的方法之一，通过激活油藏中的微生物提高采收率的技术得到重视和开发.大港油田与俄罗斯合作，从2001～2006年共开展8个区块的矿场实验，取得明显增油降水效果[2].从所用的微生物区分，MEOR技术主要包括激活油层内源微生物群落和注入地下起作用的外源微生物2种方法.较外源微生物采油技术相比，内源微生物采油技术省去菌种开发与评价、菌液发酵等繁琐过程，具有适应性广、成本低的优势，是一项潜力巨大的微生物提高采收率技术.在阐述分子生态学技术的基础上，笔者评价大庆油田聚驱后区块内源微生物资源.

1 技术背景

1.1 16S rRNA序列分析

16S rRNA序列测定与分析方法对不同细菌的16S rRNA序列进行同源性比较分析，是推断细菌的系统发育及进化关系的重要方法.它是从微生物样本中的16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息；再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，从序列差异计算它们之间的进化距离，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类.Gerrit V等[3]通过16S rRNA基因扩增克隆测序研究加拿大北部油田微生物群落的多样性，检测到多种革兰氏阴性的SRB和许多有限数量的厌氧菌、发酵菌或产醋酸菌.Yah T等[4]研究日本新泻县Kubiki 油藏内的超嗜热菌(hyperthermophiles)及其生化性质，通过16S rRNA序列分析,发现其中的超嗜热菌主要是热球菌属(Thermococcus)和栖热袍菌(Thermotoga)，超嗜热的球菌和杆菌能通过增强自身的抗饥饿能力和抗变温能力在地下油藏内生活，说明它们在地下有很大分布.

1.2 核酸探针杂交技术

核酸分子杂交技术是20 世纪70 年代发展起来的一种分子生物学技术.核酸杂交技术快速、灵敏地探测环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可以直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点得出定量的结果，从而反映相关微生物的存在及功能.探针可以是长探针,也可以是短的寡核苷酸;杂交方式可以是全细胞杂交(whole-cell hybridization) 、数量印迹杂交(quantitative dot blot)、原位杂交(in situ hybridization) 及生物芯片(biochip) .

1.2.1 数量印迹杂交

从环境样品中提取的DNA作数量印迹杂交,可获得有关特定DNA序列丰度的信息.它是基于专一性探针(如特定16S rRNA基因探针)、通用型探针(如总16S rRNA基因探针)和环境样品中分离的总DNA分别进行杂交,其特定DNA(如16S rRNA 基因序列)的相对丰度用此2类探针杂交信号的比值加以确定,用以间接反映特定的微生物细胞的数量或特定种群的相对生理活性等.Sharon A C等[5]研究被原油污染的土壤中的多环芳烃(PHA)降解菌,使用编码萘—加双氧酶的nahA基因作为探针,评估萘—加双氧酶和分枝杆菌属菌株CH1中PHA 降解酶的相似度.

1.2.2 原位杂交

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是目前原位杂交技术中较为常用的方法.它是根据已公布的、定位在不同分类等级的rDNA分子的特征位置,设计以rDNA为靶点的寡核苷酸探针；然后用荧光标记探针，用于原位鉴定单个细胞.该技术可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性、定量分析和空间位置标示.Kazuya W等[6]采用FISH研究地下储油罐中排出的地下污水，认为FISH容易低估生长缓慢且rRNA水平较低的细菌的丰度，需要配合其他方法进行研究.Yumiko K等[7]利用古生球菌属的特异性探针对被原油污染的地下水微生物群落进行FISH,对其中的古生球菌的多样性、丰度及活性进行研究.

1.2.3 生物芯片

核酸印迹杂交技术的集成化正在使分子生物学技术发生一场革命,即生物芯片(biochip)技术,又称基因芯片或DNA 阵列(DNA array),它是成千上万的网格状密集排列的基因探针.通过已知碱基顺序的DNA片段,结合被标记的具有碱基互补序列的DNA或RNA,确定其相应的类别,并由此推断环境样品中微生物的类群.尽管目前针对16S rRNA的基因芯片还处在基础研究阶段,但随着16S rRNADNA技术的广泛应用,这类产品的市场化是必然趋势.Elizaveta A B等[8]对俄罗斯西伯利亚地区Samotlor油田高温油藏内的嗜热性微生物群落进行寡核苷酸微芯片(microchip)分析,并针对嗜热菌和古生球菌设计探针.

1.3 聚合酶链式反应法(PCR)

目前依靠在PCR试验中使用具有类群特异性的引物，不进行酶切、变性、克隆和电泳等后续手段，也能够鉴别特定微生物类群的存在.竞争性PCR(competitive PCR)是其中较为常用的方法,在同一反应条件下,同一试管内同步扩增一段靶序列和另一段内参序列,作为竞争模板的内参序列与靶序列使用相同的引物,并以相同效率扩增.扩增后,当二者的质量分数相同时,理论上其模板质量分数也应相同.将待测标本与10倍系列稀释的竞争模板混合,扩增后分别用各自的荧光探针杂交,当混合标本中目的基因和内参序列信号值相同时,待测标本质量分数即为该混合物中竞争模板的稀释质量分数.Kazuya W等[9]使用8对通用古生菌引物对地下储油罐中排出的地下污水中的古菌进行16S rRNA序列分析,将其分为5个基因型,分别是KuA1、KuA6、KuA12、KuA16和KuA22,通过竞争性PCR的研究，在所有古菌拷贝中KuA12质量分数最丰富,达到50%.

1.4 PCR基因指纹图谱技术

环境样品中的微生物DNA提取物必然是不同微生物的DNA 混合物,被称为宏基因组(metagenom).将宏基因组经PCR扩增,其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物.混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度.如果将这些序列等长但不同源DNA片段分离开,则可对样品中微生物群落的组成进行初步分析.现在已有多种DNA指纹技术,如变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal RostrictionFragment Length Polymorphism，T-RFLP).其中DGGE、TGGE和RFLP在石油微生物研究中使用较为广泛.

1.4.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞,经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带.它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到1个核苷酸水平的差异.Roling等对被石油污染的海岸进行模拟研究,分析营养物质的投放及投放方式对微生物群落降解石油的影响.他们利用DGGE对微生物群落结构的变化进行表征,与没有营养物质的投放相比,固体营养物质的投放能够使石油降解速度加快,使微生物群落结构的变化加快,而液体营养物质的效果更加明显,并发现营养物质的投放使具有相同结构的微生物种群产生不同的降解速率,使具有不同结构的微生物种群产生相同的降解速率.

1.4.2 温度梯度凝胶电泳(TGGE)

TGGE 技术的基本原理与DGGE 技术相似,含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加,这种温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段.TGGE与DGGE相比,梯度形成更加便捷,重现性更强.Pu-Yi Cheung等研究石油污染土壤微生物降解多环芳烃(PAH),使用分枝杆菌(Mycobacterium)的特异性引物对环境样品进行扩增,对产物进行TGGE分离,TGGE图谱显示,重度污染土壤中微生物群落的多样性低于轻度污染土壤中微生物群落的.

1.4.3 限制性片段长度多态性分析(RFLP)

PCR-RFLP法是将PCR引物中的1条加以荧光标记,反应后用合适的限制酶切、电泳分析；再根据片断的大小以及标记片断种类和数量，分析群落的结构及组成多样性或检测因环境改变引起的微生物群落的变化.因此,人们利用PCR-RFLP研究环境微生物的多样性.Orphan等研究美国加利福尼亚州高温富硫油藏内的嗜热微生物群落，分别用细菌通用引物和古生菌引物对环境DNA 样品进行PCR扩增,建立细菌克隆文库和古生菌克隆文库；然后利用RFLP对克隆文库分别进行分析,发现硫降解菌、产甲烷菌在油藏内部具有广泛的分布,并且对C、H、S的地球生物化学循环有重要作用[1].

1.4.4 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

T-RFLP又被称为16S rRNA基因的末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment,TRF)分析技术,是一种新出现的研究微生物多态性的分子生物学技术.相对于其他的分子生物学手段,T-RFLP技术具有3个明显的优势:(1)序列数据库具有直接参考意义,即从消化产物中获得所有的末端片段大小,可以与序列数据库中的末端片段对比,可以作系统发育的推断.(2)核酸测序技术要比DGGE所依赖的电泳系统获得的结果更为可靠.(3)T-RFLP 的毛细管凝胶电泳分析更为快速,而且结果是以数据的形式输出.这是一种理想的群落对比分析方法,越来越受到人们的重视.Wen Tso Liu等利用T-RFLP法分析活性污泥、生物反应器内污泥、含沙水层中微生物种群的多样性,是最早利用T-RFLP技术进行微生物群落对比分析的研究之一.因此,可以考虑将这种分子生物学技术应用到对石油微生物群落结构的检测中,建立环境中各优势菌群的峰值图谱,在短时间内确定石油微生物种群的丰度及均匀度等各特征值,为快速检测石油微生态系统的变化提供可靠的检测标准.

2 群落组成

分别从大庆油田第一至第十采油厂的采出井、注水反排井采样126个.利用微生物的培养和计数方法，检测不同采油厂样品中含有硫酸盐还原菌、石油烃降解菌、腐生菌、铁细菌、发酵菌、硫细菌、产乙酸菌、产甲烷菌、反硝化菌等.大庆油田第一采油厂典型油井样品中各种微生物检测结果见表1.由于油井采出液直接来自于油藏油井周围的地层，而注水井反排水来自注水井周围的油藏地层，所以这些样品中的微生物反映油藏地层水中微生物群落组成，也在一定程度上反映油藏中“本源”微生物组成，所以在大庆油田油藏中各种微生物普遍存在，表现很高的多样性.

表1 大庆油田第一采油厂油井产出水内源微生物计数结果

通过对各采油厂的水驱和聚驱油层的内源微生物资源调查研究，注入水的返排水中内源微生物种类也明显多于采出水.注水井与油井的地层水中存在大量的内源微生物.注水井中存在大量的烃氧化菌、发酵菌和硫酸盐还原菌.在油井地层水中，好氧微生物数量较注水井厌氧微生物比例高，其中甲烷菌是主要的厌氧菌.好氧微生物与厌氧微生物的分布情况与本原微生物采油机理吻合.

3 水驱和聚合物驱

3.1 微生物分布状态

大庆油田主要采用水驱和聚合物驱油2种技术进行石油开采，所以水驱后和聚驱后油藏是大庆油田分布广泛的重要油藏.

图1 水驱后与聚驱后细菌总菌数分布

在水驱和聚驱后，利用微生物的功能强化原油开采代表石油开采技术的最新发展方向.为了开发水驱和聚驱后油藏微生物采油技术，分析这2类油藏油层中内源微生物的分布状态.

分别从水驱后和聚驱后油藏采取15个典型油藏采出液样品，分析其中总菌数(见图1).由图1可知，利用聚丙烯酰胺驱油后,油井采出液中微生物总数较水驱后期油藏采出液中微生物总数低2个数量级.水驱后期油藏更适合于微生物采油技术的应用.聚驱后的油藏中残留部分聚合物可以作为油藏本源菌的营养源，残留有机物的合理利用为调控聚驱后油藏微生物、开采剩余油提供途径.

3.2 驱油模式

研究含水率为95%以上的水驱后与聚驱后细菌分布，分析不同区块2种样品的结果.水驱后菌群结构是烃氧化菌—厌氧发酵菌—产乙酸盐菌—产甲烷菌的结构模式.

由于聚丙稀酰氨可以被发酵菌直接利用，聚驱后油藏的烃氧化菌比水驱后大大减少，原因是细菌利用滞留的高分子聚合物为营养源生长较慢，但油藏依然含有大量的微生物.聚驱后菌群结构是聚合物降解菌—厌氧发酵菌—产乙酸盐菌—产甲烷菌的结构模式.聚驱后的烃氧化菌比水驱后减少2～3个数量级，已经形成稳定微生物体系，有利于激活内源微生物技术，为聚驱后油藏的剩余油提供采油途径.

4 分子生态学分析

研究聚驱后油藏中的细菌和古菌，利用PCR-DGGE指纹图谱，分析16S rDNA克隆文库的序列的生物进化树(确立微生物种类)，以及油藏微生物群落的16S rDNA多态性，得到内源微生物群落的16S rRNA基因分布图谱.从分子水平上分析油藏不同区块中内源细菌和古菌的分布情况、群落结构、生物多样性，以及微生物群落中各种细菌和古菌的组成及其种群大小，研究大庆油田第一采油厂中新201站的14口井微生物群落结构.

4.1 细菌

图2 聚驱后油藏菌16S rRNA基因V9高可变区DGGE图谱

聚驱后油藏菌16Sr RNA基因V9高可变区DGGE图谱见图2.

图2表明，油井之间细菌群落的差异较大，优势菌群也不尽相同.主要的优势菌是Thauera、Petrobacter、Escherichia、Pseudomonas以及未培养细菌.Thauera是兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，具反硝化能力，在以乙酸盐、丙酸盐和乙醇等进行硝化作用时，可降解多环芳烃类物质，在废水处理中应用较多；Petrobacter菌有很好的烃降解功能；Pseudomonas的一些菌种具有烃降解功能，有些产生表活剂和一些小分子物质；Enterobacteriaceae的一些菌株产生生物表活剂，在采油中也有很好应用.这几种菌特别是Petrobacter和Pseudomonas细菌对于采油具有非常重要的意义.其他井中的优势菌群主要是Acinetobacter、Pseudomonas和Chloroflexi，其中Acinetobacter是油藏中常见的细菌，最适生长温度为33～45 ℃.一些菌株具有可产表面活性剂、乳化原油或者降解长链烷烃的功能.

在采油井和注水井中检测出多种未培养细菌，它们在油藏的微生物群落结构中起重要作用，因而还需要通过的筛选纯培养及激活实验得到更多的信息.

4.2 古菌

聚驱后油藏古菌16S rRNA基因V3高可变区DGGE图谱见图3，聚驱后油藏各井主要内源细菌的多样性分析见图4.

由图3-4可知，检测出的主要是Methanosaeta、Methanobacterium、Methanospirillum、Methanomicrobiaceae、Crenarchaeota以及一些未培养的古菌.其中注水井中的优势菌群Methanosaeta及未培养古菌在采油井样品中未检测出，而其余少量的Methanobacterium、Methanomicrobium、Methanospirillum及未培养古菌在注入井和采油井中有分布，且在采油井中数量显著增加，同时采出水中未培养古菌的种类也有所增加.这证实封闭的厌氧环境更适于产甲烷古菌的生长.

注水井中的优势菌Methanosaeta的最适生长温度为55～60 ℃，且只能以乙酸盐为底物发酵产甲烷，该地层的温度在42°左右.由于油田长期回注水，且与外界开放环境相通，导致注水井地层条件发生改变，形成适宜该属古菌生长的环境，使该属成为注水井的优势菌群，并随着向采油井的趋近，温度等条件与原始条件愈加接近，该菌的生长条件不能得到满足，所以在采出液中并未检测到.

图3 聚驱后油藏古菌16S rRNA基因V3高可变区DGGE图谱

图4 聚驱后油藏各井主要内源细菌多样性

其余种属的古菌最适生长温度为33～50 ℃，故在注水井和采油井中有分布.采油井的优势菌群Methanomicrobium、Methanospirillum和Methanobacterium以氨作为唯一氮源，以硫化物作为硫源，以H2/CO2或者甲酸盐作为底物生成甲烷，是油田常见的古菌，在其他油田油井样品中被检测出.产甲烷菌的作用发生在生物降解的末端，它们在深层油藏原油的厌氧烃降解过程中发挥作用.同时，由图3-4还可知，在检测出的古菌中，未培养的古菌占比例很大，尤其是其中的一些还是优势菌属，由于古菌生长条件的特殊性，导致绝大多数的菌未能被培养，所以对于这些菌的利用也非常有限，如果能在实验室条件下，寻找合适的培养条件对古菌进行纯培养，这对于微生物采油具有重要意义.

5 结论

(1)大庆油藏水驱和聚驱后期油层中含有种类多、数量高的微生物群落，包括烃氧化菌、甲烷菌、发酵菌等，其地层中微生物群落的多样性为大面积采用内源微生物采油技术提供条件.

(2)细菌的DGGE分析结果表明，聚驱后区块14口井中，在注水井周围细菌群落结构比较稳定，而各采油井中的细菌种类和数量有很大差异.在采油井中检测到的细菌主要是变形菌纲的陶厄氏菌属、油杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和肠杆菌科微生物.聚驱井组水样中DGGE检测出的优势古菌菌群主要是产甲烷菌(甲烷微菌科、甲烷螺菌属和甲烷杆菌属)，在深层油藏的厌氧烃降解过程中发挥作用.

(3)聚驱后油藏中存在众多微生物，区块的本源菌数量为103～104个/ mL.微生物种类和数量与邻近的水驱油藏差别不大，聚驱后油藏具有开展内源微生物驱资源基础.