5种酚类化合物对3种水生生物的毒性作用*

许文武 孟 菁 胡 威 章 典 张庭廷＊＊

(1.安徽师范大学生命科学学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，芜湖，241000;2.安徽师范大学环境科学学院，芜湖，241000)

5种酚类化合物对3种水生生物的毒性作用*

许文武1孟 菁2胡 威1章 典1张庭廷1＊＊

(1.安徽师范大学生命科学学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，芜湖，241000;2.安徽师范大学环境科学学院，芜湖，241000)

通过测定藻细胞密度和溞数量的变化，研究了5种酚类化合物对蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和多刺裸腹溞(Moina macrocopa)3种水生生物的影响.结果表明，在实验第6天，随酚类化合物浓度增加，藻细胞密度与对照组相比明显下降，多刺裸腹溞48 h死亡率增高，呈现剂量-效应关系.对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯酚、2，4-二硝基酚和2，4，6-三硝基酚5种酚类化合物在第6 天对蛋白核小球藻的半抑制效应浓度(ErC50)值依次为:7.73 、25.21、33.19、38.51 和 25.08 mg·L－1;对斜生栅藻依次为:9.13、30.28、40.77、48.09 和 16.09 mg·L－1;在 48 h，对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚对多次裸腹溞的半致死效应浓度(LC50)值分别为:1.92、10.75、15.53、15.68和9.87 mg·L－1.5种酚类化合物对3种水生生物的毒性研究表明，对苯二酚的毒性最强，2，4-二硝基酚的毒性最弱.

水生生物，酚类化合物，急性毒性.

酚类有机污染物是一种中等强度的化学毒物，能够引起蛋白质变性，使细胞中毒或死亡［1］.许多工厂如煤气、焦化、炼油、冶金、石油化工、造纸、医药、农药等排放的废水中均含有酚类化合物.这些废水若不经过处理直接排放，或者虽经处理但未能达到排放标准，就会造成水、土壤和大气环境污染，危害生态环境和人体健康.

在探讨酚类化合物的毒性以及预测该类化合物的毒性大小的试验中，常采用绿藻或大型水溞作为指示生物.绿藻类是水生生态系统中的初级生产者，也是水生食物链的基础环节，其种类多样并直接影响水生态系统的结构和功能［2-3］，是较为理想的化学物质测试生物［4］.同样，溞类是水体中初级生产者(藻类)和消费者(如鱼类)间的中间环节，其繁殖速度快，生活周期短，培养简便，对许多毒物敏感，世界各国广泛使用溞类进行水生生态毒理学研究［5-6］.由于酚类化合物导致的水体污染必然危及水生生物，因此通过酚类化合物对绿藻、溞毒性的研究，探讨酚类化合物对水生生态系统的影响［7-8］有着重要的意义.

本文选取毒性试验中常用的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和多刺裸腹溞(Moina macrocopa)作为受试对象，研究了酚类化合物对3种水生生物的毒性效应，为制定酚类化合物相关的环境标准提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚、2，4，6-三硝基酚，购自国药集团化学有限公司.

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学院水生生物研究所.两种藻均用HB-4培养基培养.

多刺裸腹溞(Moina macrocopa)由日本长崎大学提供.

1.2 实验用液的制备

HB-4 培养基主要成分:(NH4)2SO4，0.2 g·L－1;K2HPO4，0.015 g·L－1;CaCl2，0.015 g·L－1;MgSO4·7H2O，0.08 g·L－1;NaHCO3，0.1 g·L－1;KCl，0.025 g·L－1;FeCl3，0.15 mL·L－1;土壤浸提液，2 mg·L－1.

土壤浸提液的制备:采取未施肥土500 g，加蒸馏水1000 mL后搅匀，浸泡1 d，100℃水浴锅加热2 h.上清液过滤，灭菌，冷藏，保存.

1.3 培养方法

实验前一周，蛋白核小球藻和斜生栅藻于培养箱中进行扩大培养，培养条件为:温度(24±2)℃，光照强度4000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天摇动培养瓶3—5次，使藻类生长进入对数生长期.

多刺裸腹溞在培养箱内((24±2)℃)，光暗比为12 h∶12 h，光强为4000 lx条件下进行培养.所用培养液为曝气自来水，每2—3 d更换1次，每天喂养1次斜生栅藻浓缩悬浮藻液，斜生栅藻的投喂密度为1.0 ×106cells·mL－1［9］，藻液的颜色为淡苹果绿色.实验前把怀卵量多的雌溞用玻璃吸管吸出，用100 mL小烧杯分开单个喂养，实验材料为1日龄幼溞.

1.4 酚类化合物对蛋白核小球藻和斜生栅藻的毒性作用

HB-4培养基配制5种酚类化合物母液，再根据预实验结果，确定5种酚类化合物对蛋白核小球藻的急性毒性试验的浓度范围，一定量的培养基稀释，现用现配.取对数生长期的蛋白核小球藻和斜生栅藻分别加入100 mL的锥形瓶中，再加入稀释的毒物到所需浓度，使各藻类的起始密度为6×105cells·mL－1左右，每组3个平行，另各设一个空白对照即只含对应的培养基和相同浓度的藻液，将藻液放入1.2所述条件下进行培养，实验周期为6 d，每隔48 h取藻液采用血球计数板计数.

1.5 酚类化合物对多刺裸腹溞的毒性作用

多刺裸腹溞以10个为一组，根据预实验的结果分别设定毒物的浓度，同时设1个空白对照组，每组3个平行，培养48 h，期间不投喂食物，每隔24 h观察记录每个烧杯中多刺裸腹溞的死亡数目(多刺裸腹溞死亡标准为旋转烧杯观察沉到杯底部的多刺裸腹溞在1—2 min内不能游动视为死亡［10-11］).

1.6 数据处理

实验数据采用SPSS V17.0软件包进行独立样本检验统计分析，P＜0.05为显著性差异.

酚类化合物对两种藻类的平均比生长速率(μ)计算公式为:μ=lnNn－lnN1/(tn－t1);式中:N1为t1时的藻细胞数，Nn为 tn时的藻细胞数.抑制率(%)=(μ对照组－ μ处理组)/μ对照组×100%.根据抑制率(y)与相应的浓度对数(x)，用直线回归法得到浓度效应方程:y=b×x+a.当抑制率为50%时，得到的浓度对数取反对数即为所求半抑制效应浓度(ErC50)［12-13］.

酚类化合物对多刺裸腹溞抑制率(IR)的计算公式为:IR(%)=(1－N/N0)×100%;其中，N为多刺裸腹溞个数;N0为空白对照组多刺裸腹溞个数.将死亡率换算成概率单位.根据酚类化合物质量浓度对数与抑制率的概率单位作一元线性回归方程:y=b×x+a，抑制率的概率单位为5时，得到的浓度对数取反对数即为所求半致死效应浓度LC50，再计算出LC50的95%置信限.

2 结果与讨论

2.1 5种不同浓度的酚类化合物对蛋白核小球藻生长的影响

5种酚类化合物对蛋白核小球藻的急性毒性结果如图1，由图1可见，蛋白核小球藻对照组在实验期内藻细胞个数持续上升，而实验组中除间苯二酚处理后的第2天藻液密度大于对照组密度外，其余各组均随着酚类化合物浓度的增加，藻的生长抑制作用增强.

蛋白核小球藻的生长抑制率(y)按实验第6天的结果计算，将抑制率与浓度(x)进行线性相关分析，结果列于表1，由表1可知，5种酚类化合物对蛋白核小球藻急性毒性结果的各方程相关系数大于0.9，P＜0.05，具有良好相关性，表明本实验结果准确可信.根据各相关方程求得对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚对蛋白核小球藻的 ErC50分别为 7.73 、25.21、33.19、38.51和25.08 mg·L－1.根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154—2004)中的分级标准［14］，对苯二酚对蛋白核小球藻属高毒，其余4种酚类化合物均属中毒，毒性大小依次为:对苯二酚 ＞2，4，6-三硝基酚 ＞ 间苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚 ＞2，4-二硝基酚.

图1 5种酚类化合物(mg·L－1)对蛋白核小球藻细胞密度的影响Fig.1 The effect of five phenol compounds(mg·L －1)on Chlorella pyrenoidosa Chick

表1 5种酚类化合物作用于蛋白核小球藻的ErC50以及回归方程(第6天)Table 1 ErC50and regression equations for five phenol compounds on Chlorella pyrenoidosa Chick(the sixth day)

2.2 5种不同浓度的酚类化合物对斜生栅藻生长的影响

5种酚类化合物对斜生栅藻的急性毒性试验见图2，由图2可见，5种酚类化合物对斜生栅藻的毒性实验结果和对蛋白核小球藻一致，即低浓度时抑制不明显，随着处理浓度的增大，抑制作用明显加剧.

斜生栅藻的生长抑制率同样按第6天的实验结果进行计算，将抑制率与浓度(x)进行线性相关分析，方程如表2，由表2可知，各方程相关系数大于0.9，P＜0.05，实验数据可靠.对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚对斜生栅藻的 ErC50分别为 9.13、30.28、40.77、48.09 和16.09 mg·L－1.根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154—2004)中的分级标准［14］，对苯二酚对斜生栅藻表现出的毒性属高毒，其余4种酚类化合物均属中毒，且毒性大小依次为:对苯二酚 ＞2，4，6-三硝基酚 ＞ 间苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚 ＞2，4-二硝基酚.

图2 5种酚类化合物(mg·L－1)对斜生栅藻细胞密度的影响Fig.2 The effect of five phenol compounds(mg·L －1)on Scenedesmus obliquus

表2 5种酚类化合物作用于斜生栅藻的ErC50以及回归方程(第6天)Table 2 ErC50and regression equations for five phenol compounds on Scenedesmus obliquus(the sixth day)

2.3 5种不同浓度的酚类化合物对多刺裸腹溞的影响

5种酚类化合物对多刺裸腹溞的毒性作用见表3.由表3中实验数据求出各时间内浓度与概率单位的回归方程以及LC50的95%置信限(表4).由表4可以看出，根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154—2004)中的分级标准［14］，5种酚类化合物对多刺裸腹溞有不同的毒性作用，其中(在24 h或48 h)对苯二酚对水溞表现为高毒，其余的4种酚类化合物表现为中毒.在48 h时，5种酚类化合物对多刺裸腹溞的毒性大小依次为:对苯二酚＞2，4，6-三硝基酚＞间苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚＞2，4-二硝基酚.

表3 5种酚类化合物对多刺裸腹溞的毒性实验结果Table 3 The toxicity experiment results of the five phenol compounds

表4 毒性试验的回归方程、LC50值(mg·L－1)和95%置信限Table 4 Regression equation，LC50values(mg·L －1)and 95%confidence limits of toxicity

上述实验结果表明5种酚类化合物对水生生物具有一定的毒性.已有研究表明，中毒时间越长，产生半数致毒效应所需的浓度越低，即LC50或ErC50值越低［15］，本实验发现5种酚类化合物对多刺裸腹溞的研究也符合此种情况.

有研究认为酚类化合物透过生物膜进入生物体内与生物体内的作用位点发生反应［12］.Baziramakenga等指出多酚类物质能够降低矿物质和水分的吸收而抑制植物的生长［16］.根据本次试验结果，2，4，6-三硝基酚对生物的毒性大于2，4-二硝基酚，即随着硝基取代基的增加，硝基苯类物质毒性越大，这与王宏等［17］研究结果一致.若将ErC50或LC50值的十分之一作为安全浓度［15］，则对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚对蛋白核小球藻安全浓度分别为 0.773、2.521、3.319、3.851 和 2.508 mg·L－1;对斜生栅藻安全浓度分别为 0.913、3.028、4.077、4.809 和1.609 mg·L－1;对多刺裸腹溞安全浓度分别为 0.192、1.075、1.553、1.568 和 0.987 mg·L－1，可取其中的最低值(对苯二酚为 0.192 mg·L－1、间苯二酚为1.075 mg·L－1、2，4-二氯苯酚为 1.553 mg·L－1、2，4-二硝基酚为1.568 mg·L－1和2，4，6-三硝基酚为0.987 mg·L－1)作为 5 种酚类化合物对水中浮游生物的安全阈值.

因此，在评价某种化学物质的毒性等级并探讨其对水生生态系统的毒性影响时，必须综合考虑包括浮游植物、浮游动物等多种形态水生生物的毒理学研究结果，才能得出较为准确的评价.另酚类化合物具有显著的生物积累性，可沿食物链传递并最终危害人体健康.因此，即使水中酚类化合物含量不高，也会对人类健康存在潜在危险，应引起各级部门的高度重视.

3 结论

不同浓度的5种酚类化合物处理后，3种水生生物的生长存在不同程度的减慢，表现为浓度越高，生长抑制效应越强.其中对苯二酚的毒性最强，2，4-二硝基酚的毒性最弱.

5种酚类化合对3种水生生物的毒性试验结果均具有较好的剂量-效应线性关系.对苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚对水中浮游生物的安全阈值分别为 0.192、1.075、1.553、1.568和0.987 mg·L－1.因此严格控制酚类化合物的排放标准对生产、生态环境和人类健康尤为重要.

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THE TOXIC EFFECTS OF FIVE PHENOL COMPOUNDS TO THREE DIFFERENT AQUATIC ORGANISMS

XU Wenwu1MENG Jing2HU Wei1ZHANG Dian1ZHANG Tingting1

(1.College of Life Sciences，Anhui Normal University，The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province，Wuhu，241000，China;2.College of Environmental Science，Anhui Normal University，Wuhu，241000，China)

Based on the measurement of algae cell density and daphnia quantity，the inhibitory activities of five phenol compounds against three different aquatic organisms，i.e.Chlorella pyrenoidosa Chick，Scenedesmus obliquus and Moina macrocopa were tested.The results showed that the algal cell density was reduced significantly on the sixth day and the quantity of Moina macrocopa decreased sharply in 24 h with increasing phenol concentration，exhibiting a good concentration-effect relationship.On the sixth day，ErC50of hydroquinone， resorcinol， 2，4-dichlorophenol， 2，4-dinitrophenoland 2，4，6-nitro-phenolon Chlorella pyrenoidosa were 7.73，25.21，33.19，38.51 and 25.08 mg·L－1respectively，and those on Scenedesmus obliquus were 9.13，30.28，40.77，48.09 and 16.09 mg·L－1respectively.The 48 h LC50of hydroquinone，resorcinol，2，4-dichlorophenol，2，4-dinitrophenol，and 2，4，6-nitro-phenol on Moina macrocopa were 1.92，10.75，15.53，15.68 and 9.87 mg·L－1respectively.The results showed that hydroquinone had the strongest toxicity while 2，4-dinitrophenol had the weakest toxicity in the five phenol compounds.

aquatic organisms，phenol compounds，acute toxicity.

2010年11月19日收稿.

*国家自然科学基金资助项目(30870429);安徽省高校省级自然科学基金重点项目(KJ2008A084)资助.

＊＊通讯联系人，E-mail:cyhztt@mail.ahnu.edu.cn