菊花显微特征常数与化学成分相关性研究

吴楠，李娜，刘歆韵，康廷国

（辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

菊花显微特征常数与化学成分相关性研究

吴楠，李娜，刘歆韵，康廷国*

（辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

目的：探讨菊花的显微特征常数与其化学成分的相关性。方法：采用容量分析方法测定菊花粉末中的花粉粒的显微特征常数值，采用高效液相法对菊花中指标性成分绿原酸进行含量测定，用统计方法对得到的两组数据进行相关性分析。结果：菊花中花粉粒的显微特征常数与绿原酸含量呈中相关，且为正相关。结论：测定菊花的显微特征常数值，可作为其药材质量控制的手段之一。

菊花；显微特征常数；绿原酸；相关分析

中成药显微定量法是利用药材自身的某种显微特征具有固定常数的特点，采用容量分析法测定中成药中药材含量的一种方法。药材的显微特征常数与其化学成分是否具有相关性尚未见报道。本实验对菊花中花粉粒显微特征常数与其化学成分进行了线性相关研究，以探讨药材中所含无机物与有机物是否具有相关性，旨在为评价菊花的质量提供一种新的方法。

菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，其味甘、苦，微寒。入肺、肝经。散风清热，平肝明目，清热解毒。用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒。绿原酸、木犀草苷为菊花中有效成分［1］。

菊花粉末中的花粉粒显微特征明显，不仅具有生物学稳定的特性，而且数量众多，易于观察计数［2-4］。本实验采用容量分析方法测定了菊花中花粉粒的显微特征常数，采用高效液相法对菊花中的指标性成分绿原酸进行了含量测定，并对得到的结果进行了相关性分析［5］。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

OLYMPUSBX-50生物显微镜；OLYMPUSDP-10显微镜数码相机；岛津 AY220电子分析天平；Agilent1100高效液相色谱仪；微量移液器（WKY型－球晶生化试剂仪器有限公司）；FW80高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂

水合氯醛，稀甘油；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所）；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.3 材料

所有菊花样品均经辽宁中医药大学药学院中药鉴定教研室翟延君教授、李峰教授鉴定为正品，具体来源见表1。

表1 菊花样品来源

2 方法与结果

2.1 菊花中花粉粒显微特征常数测定优化条件选择

影响样品混悬效果的因素主要有样品重量、样品的粉碎粒度、混悬剂的用量。考虑到各因素的考察水平有所不同，故本实验采用3因素6水平均匀设计法考察菊花显微定量法的优化条件［6］，具体实验设计见表2。

取菊花样品粉碎，分别过80目和100目筛。精密称定50，60，70，80，90，100 mg共6份，用水合氯醛试液多次水飞，移入25mL量瓶中，按均匀设计表加入相应甘油量，最后用水合氯醛液定容。充分摇匀后，精密吸取0.02mL进行显微装片，每份溶液平行装片50张，于显微镜下观察花粉粒并计数。将所得的结果随机分为5组，分别计算5组平均值的RSD。以每份样品平均值的RSD为考察指标，实验结果见表3。

表2 菊花中花粉粒显微特征常数测定均匀设计方案U6（63）

表3 菊花中花粉粒显微特征常数测定均匀设计实验结果

通过SPSS 15.0统计软件得出均匀设计结果，Y＝9.385－0.062X1，r＝0.906，F＝62.856，Ymin＝3.185（即3.185%）。式中Y为 RSD（%），X1为样品重量，X2为粉碎粒度，X3为加入甘油量。经SPSS 15.0统计软件得出其他变量P值均大于0.05，与Y值无显著的相关性。即优化条件为：样品称样量100 mg，粉碎过100目筛，加入甘油7mL。

2.2 均匀设计验证实验

对优化结果进行验证实验，结果表明各份样品的变异系数均与优化条件给出的最小变异系数（3.185%）接近，说明由SPSS 15.0统计软件给出的优化条件是科学、准确的，结果见表4。

表4 菊花中花粉粒显微特征常数测定均匀设计验证实验结果

2.3 菊花各样品显微特征常数值测定

分别精密称定10种菊花粉末，按照均匀优化条件配制，水合氯醛多次水飞，分别定容于25mL量瓶中，精密吸取10μL溶液，分别平行装片50张，观察花粉粒，计数，取平均值，计算花粉粒显微特征常数值，公式：P＝（X×V）／（V′×W），式中W－药材重量（mg，按干燥品计），V－定量药材混悬液总体积（mL），P－定量药材显微特征常数（个·mg－1），V′－盖玻片下药材混悬液体积（mL），X－每片盖玻片下药材显微特征数，结果见表5。

表5 菊花中花粉粒显微特征常数测定结果

2.4 高效液相色谱法测定绿原酸的含量

2.4.1 色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%磷酸溶液－乙腈（85∶15）为流动相；检测波长为348nm。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品，加70%甲醇配制成每lmL含绿原酸35μg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过1号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率45 kHz）40min，放冷再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定方，即得［1］。

2.4.5 测定结果 见表6。

2.5 相关性分析

这两组数据均经过正态分布检验且均符合进行相关性分析的条件，再用SPSS 15.0统计软件对菊花样品中花粉粒显微特征常数与绿原酸的含量做相关性分析，结果表明，绿原酸的含量与菊花中花粉粒显微特征常数有相关性，且呈正相关，即显微特征常数愈大，绿原酸含量愈大。绿原酸与花粉粒的回归方程：Y＝177.27X＋262.34，r＝0.697，P＝0.037（P＜0.05），有统计学意义。

表6 菊花中绿原酸含量测定结果

《中国药典》2010年版规定，菊花按干燥品计算，含绿原酸（C16H18O9）计，不得少于0.20%。由所得回归方程可知，含量达到《中国药典》标准的菊花粉末中花粉粒的显微特征常数应不少于262.7个·mg－1。

3 讨论

本实验采用容量分析法测定菊花显微特征常数，定容和制片很关键，用微量移液器装片前枪头要润洗3次，吸取前要使混悬液均匀分布，且尽量将枪头伸入中间位置吸取，每次吸取前要充分摇匀，以减少误差。盖盖玻片时要将载玻片上的溶液全部覆盖，避免外溢现象。在显微镜下视野按 “之”字形观察，不可重复计数［7-9］，不可遗漏。

基于花粉粒显微鉴定专属性强、稳定性好、制片简单、特征明显易辨认的特点，建议《中国药典》增加某些花类、含花全草类以及含花类原粉的中成药的花粉粒显微鉴定标准，使花粉粒在显微鉴定中发挥更大作用。

建议《中国药典》将显微特征常数与化学成分具有显著相关性的药材项下增加显微特征常数测定项，丰富药材品质评价的内容；同时将含有这些药材（原粉入药）的中成药项下增加显微定量项。另外，杭菊在蒸制过程中花粉粒数量是否有变化尚需进一步研究。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：292.

［2］康廷国.中药鉴定学［M］.北京：中国中医药出版社，2003.

［3］徐国钧.中药材粉末显微鉴定［M］.北京：人民卫生出版社，1986.

［4］栾晓静，苑冬敏，康廷国.草酸钙簇晶在中药显微鉴定中的应用［J］.辽宁中医药大学学报，2006，8（5）：137.

［5］苑冬敏，栾晓静，康廷国.中药显微定量法的应用研究［J］.辽宁中医杂志，2006，（4）：444-445

［6］刘明芝，周仁郁.中医药统计学与软件应用［M］.北京：中国中医药出版社，2006：8.

［7］栾晓静，苑冬敏，康廷国.五子衍宗丸中枸杞子的显微定量研究［J］.辽宁中医杂志，2007，34（5）：646.

［8］苑冬敏，刘扬，康廷国，等.黄柏的显微定量研究［J］.中华中医药学刊，2007，25（5）：964.

［9］刘歆韵，刘丽，康廷国，等.白芍显微特征常数与化学成分相关性研究［J］.中药材，2010，33（4）：559.

Research of Correlation of Microscopic Characteristic Constants and Chemical Components of Chrysanthemi Flos

WU Nan，LINa，LIU Xin-yun，KANG Ting-guo
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

Objective：Discussion of the microscopic characteristics of chrysanthemi flos constant chemical composition and its relevance.Methods：Determination of the capacity analysis of chrysanthemi flos powder pollen number of the microscopic characteristics and the use of HPLC chrysanthemi flos of indicators of the chemical constituents chlorogenic acid，statistical methods used to obtain two sets of data for correlation analysis.Results：Chrysanthemi flos powder pollen and the microscopic characteristics chlorogenic acid significant content related to each other.ConclusionDetermination of the microscopic characteristics of chrysanthemi flos constant value，its ingredients can be used as a means of quality control.

Chrysanthemi flos；Microscopic characteristics of constant；Chlorogenic acid；Correlation analysis

*康廷国，E－mail：kangtg＠lnutcm.edu.cn

2010-10-20）