高效液相色谱法测定银芩胶囊中黄芩苷的含量

湖南省衡阳市中心医院（421001）颜滢

湖南省南华大学附一医院（421001）李卓

银芩胶囊是由金银花、黄芩、鱼腥草、散去叶合理配方所制成的硬胶囊剂，其内容物为黄色至黄褐色颗粒和粉末，气微，味苦。本品具有清热解毒，清宣风热之功效，用于外感风热所致的发热、咳嗽、咽痛及呼吸道感染见以上症状者[1]。本品尚未收载入《中国药典》，为了有效控制药品质量，确保该制剂的疗效，本文以方中主药黄芩的有效成分黄芩苷为定量控制指标，采用高效液相色谱法（HPLC）测定银芩胶囊中黄芩苷的含量，方法简便、准确，现报告如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津SPD-10AVP高效液相色谱仪，包括LC-10ATVP-一元高压泵，SPD-10AVP紫外检测器，CTO-10ASVP柱温箱，S C L-1 0 A V P 系统控制器；LibrorAEG-200电子天平(日本岛津制造所)；Millipore simplicity-185超纯水器(美国密理博公司)；LS-3120 超声波发生器(美国科学系统公司)；RE- 52A 旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)。

1.2 试药 甲醇(色谱纯) ；磷酸(分析纯) ；四氢呋喃(分析纯) ；黄芩苷对照品(由中国药品生物制品检定所提供，批号为110715-200815，含量测定用) ；银芩胶囊(昆明制药集团股份有限公司生产，批号090611、091121和091125)及其空白样品由某有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2～5]色谱柱：大连依利特C18柱( 250mm×4mm, 10μm) ；流动相:甲醇- 磷酸- 四氢呋喃( THF) ( 45: 55: 6) (磷酸为pH=2.7 的磷酸水溶液)；流速:1ml/min；柱温:25℃；检测器波长:280nm。

2.2 系统试用性试验 按供试品含量测定项下方法制备对照品溶液, 取该对照品溶液、供试品溶液各20μl, 注入液相色谱仪。理论塔板数以黄芩苷计, 理论板数n=3.54(tR／Wh/2)2=3486，说明在选定的条件下，色谱柱的某些条件如柱长、载体性能及色谱柱填充均符合要求，测定效果良好；分离度R>1.5。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品(60℃减压干燥至恒重) 3.7mg，置于100ml容量瓶中，加20ml甲醇超声20min，完全溶解后加水至刻度，0.45μm的滤膜过滤制成对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取银芩胶囊3盒，每盒随机取10粒，除去胶囊壳，取本品胶囊内容物约2.5g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇45mL，超声处理40min，放冷后，甲醇定容至刻度，摇匀，静置，经0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.3”项下的对照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml 与10ml容量瓶中，70%甲醇定容，混匀。各精密进样20μl，测得峰面积，以峰面积对浓度(μg/ml) 进行线性回归，结果表明在3.7～29.6μg/ml的浓度范围内，线性关系良好。标准曲线为: Y=57417x- 31303，γ=0.9998。

2.6 进样精密度试验 取“2.3”项下对照品溶液5ml置于10ml 的容量瓶中，70% 的甲醇定容至10ml，经过0.45μm 的微孔滤膜过滤，滤液重复进样5次，每次进样20μl，依据测定结果计算RSD为0.67%( n=5) ，小于2.0%，符合要求。

2.7 稳定性试验 取“2.3”、“2.4”项下对照品溶液，供试品溶液，分别在0、2、4、12、24h时注入液相色谱仪中测定，测得黄芩苷的相对标准偏差分别为1.5%、2.3%，说明对照品溶液、供试品溶液在24h内稳定。

2.8 重现性试验 精密吸取样品批号为091106的银芩胶囊，按“2.4”项下的方法制备5份，分别进样20μl，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，测得黄芩苷平均含量为3.19mg/ml，RSD=1.6%(n=5) ，说明本方法重现性良好。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的样品（批号090611），精密吸取6 份，分别加入一定量的黄芩苷对照品，按“2.4”项下方法制备，并按“2.1”项下的色谱条件进行测定，试验结果见附表1。

2.10 样品含量测定 精密吸取按“2.4”项下的方法制备的供试品溶液各20μl，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，4批供试品含量测定结果详见附表2。

附表1 加样回收率试验结果（n=6）

附表2 样品含量测定结果（n=5）

3 讨论

3.1 在流动相选择方面，通过调节比较水和甲醇的比例，溶液的pH 值、流动相中TPF的含量等几方面，以获取最佳的分析条件。经过多次实验，得出如下结论：①增加甲醇比例，增加洗脱能力，减小保留时间，但是理论塔板数就会减小，不能达到要求，并使样品的峰分离不完全。②水相的比例增加，作用和甲醇相反，增加比例就会使理论塔板数增大，但是当比例达到65%以后，保留时间远大于20min，故不宜采用。③因为实验所用高效液相色谱柱的pH适用范围是2～8，酸性太强和碱性太强，易使柱内填料变性，致使柱效降低，为保证柱效采取磷酸溶液调节纯化水到pH 值为2.7。④流动相中加入适量的四氢呋喃可改善峰型，使理论塔板数增大，最终确定流动相为甲醇-磷酸-四氢呋喃（45: 55: 6），能保证分离效果好，出峰时间短，柱效高。

3.2 取质量浓度为10μg/mL 的对照品溶液，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，结果在280nm 波长处有最大吸收，故以280nm为检测波长。

3.3 该方法简便易行、准确度高、被测溶液稳定，可作为银芩胶囊中黄芩苷的含量测定方法来对银芩胶囊进行质量控制。