重组人干扰素α-2b原位凝胶滴眼剂对兔小梁切除术后滤过瘢痕的影响△

余晓波 魏刚 孙兴怀 陈君毅

青光眼的滤过性手术仍是目前青光眼的主要治疗手段，但2年失败率达15% ～30%。失败的主要原因是手术区滤过口处成纤维细胞增殖，瘢痕形成而使滤过泡功能减退［1］。因此，要提高青光眼治疗的手术成功率，解决滤过泡瘢痕化是关键问题。近年来的研究发现，干扰素 α-2b(interferon α-2b，IFNα-2b)具有广谱的抗纤维化作用，并且已经应用到青光眼滤过术后的抗瘢痕治疗中［2］。目前临床常用IFN的使用方法多为滴眼液或球结膜下注射。药物滴眼后立即被结膜囊中的泪液稀释，并很快从泪道排出，因此生物利用度低，作用时间短暂，需反复频繁滴眼，患者依从性也较差。作为一种有创性的给药方式，结膜下注射会给患者带来不必要的痛苦，并具有出现眼球穿破等并发症的潜在风险。采用高分子亲水性聚合物为基质的凝胶剂近年来作为药物载体受到医药界的重视。温度敏感原位形成凝胶(简称原位凝胶)滴眼剂室温下为液体，滴入眼表转变为凝胶，可以延长药物与角膜上皮或结膜之间的接触时间，降低全身不良反应的同时，改善眼部生物利用度，局部定位给药或持续给药。本研究旨在观察IFN α-2b原位凝胶滴眼剂与传统IFN α-2b滴眼液在家兔实验性滤过手术后的抗瘢痕化作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康雌性或雄性新西兰大白兔10只，体质量2.2～2.8 kg。采用随机数字表法分为两组，每组各5只(10眼)。所有大白兔均进行双眼小梁切除手术。设定右眼为实验眼，术后给予IFN滴眼;左眼为对照眼，术后只给予抗生素滴眼。所有手术操作均由同一名医师完成。

1.2 主要药物 ①重组IFN α-2b温度敏感原位凝胶的制备:原料药使用注射用重组IFN α-2b冻干粉针剂(安徽安科生物工程股份有限公司，商品名:安达芬粉针)。凝胶基质:聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic F127，巴斯夫公司;商品名:泊洛沙姆)。所有原位凝胶药物均在复旦大学药学院制备。制备完成的在位凝胶中IFN α-2b浓度:20万IU/mL。凝胶凝固温度约为30℃。②重组IFN α-2b滴眼液(安徽安科生物工程股份有限公司，商品名:安达芬滴眼液)，IFN浓度:20万IU/mL。

1.3 实验方法 建立兔眼滤过手术模型:全部家兔均使用氯胺酮(50 mg/kg)和氯丙嗪(25 mg/kg)肌内注射麻醉。升汞及无菌注射用水冲洗结膜囊，常规眼部区域消毒、铺巾。手术显微镜下用直肌牵引线将上直肌牵向鼻侧，暴露颞上象限巩膜。沿角巩膜缘做以穹隆为基底的结膜瓣，暴露表层巩膜，热凝止血，结膜下Tenon囊组织均不切除。制作以角膜缘为基底3 mm×3 mm的方形半厚板层巩膜瓣，并分离直至透明角膜。切除2 mm×1.5 mm角巩膜组织，不做虹膜根切。巩膜瓣两个角处以10-0丝线各缝合1针，8-0可吸收缝线缝合球结膜。

术后用药:所有术眼每天均滴硫酸庆大霉素眼液(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院制剂室)，4次/d。然后第1组手术后第2天开始右眼加IFN α-2b原位凝胶4次/d滴眼，持续用药至术后14 d;第2组手术后第2天开始右眼加IFN α-2b滴眼液4次/d滴眼，持续用药至术后14 d。

眼压(intraocular pressure，IOP)测定:于术前及术后每7 d使用Tonopen(Reichert Ophthalmic Instruments，美国)测量家兔双眼IOP。测量前使用盐酸奥布卡因滴眼液(日本参天制药株式会社，商品名:倍诺喜)进行表面麻醉3次，测量时尽量使动物保持安静。

术后第1周每天、第2周起隔天用裂隙灯观察眼部情况，包括结膜、角膜、前房、晶状体等，并用直接检眼镜检查眼底。眼睑、结膜反应按轻重分为3级:0级:眼睑无红肿，结膜不充血;I级:眼睑无红肿，结膜轻度充血、水肿;II级:眼睑红肿，结膜明显充血、水肿。角膜上皮用1% 荧光素钠染色。

1.4 切片制作与观察 术后28 d，使用空气栓塞法处死全部家兔，并立即行眼球摘除。取小梁切除手术部位10 mm×10 mm眼球壁组织，立即使用4%戊二醛固定。石蜡包埋后切片，苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色，低倍镜下观察HE染色切片。

1.5 统计学处理 使用配对t检验分析两组家兔间IOP差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IOP变化 第1组家兔术后各时间点右眼IOP均较左眼 IOP 低(P 值分别为 0.000、0.011、0.000、0.009);第2组术后各时间点右眼 IOP也均较左眼IOP 低(P 值分别为0.010、0.145、0.012、0.040);术后各时间点IFN α-2b原位凝胶眼IOP均低于IFN α-2b滴眼液眼，但差异无统计学意义(P值分别为0.347、0.328、0.640、0.346)(图 1)。

图1 两组家兔手术前后IOP变化曲线(1 mm Hg=0.133 kPa)

2.2 不良反应 在整个实验过程中，两组实验组所有家兔均存活。全部术眼均未表现出明显的眼前节炎症反应，角膜均保持透明。所有术眼均未发现眼内炎表现。实验组眼与对照组眼相比，结膜充血程度相似。

2.3 HE染色观察 术后4周，小梁切除手术部位HE染色显示，对照眼巩膜瓣下可见大量增生的纤维结缔组织，成纤维细胞丰富，滤过泡间隙消失(附1页图2)。IFN α-2b滴眼液组巩膜瓣下纤维结缔组织明显较对照组少，成纤维细胞相对较少，并可见部分滤过泡间隙(附1页图3)。IFN α-2b原位凝胶组可见巩膜瓣下结缔组织形态较规则，成纤维细胞较少，可见明显滤过泡间隙(附1页图4)。

3 讨论

IFN是一类具有广泛生物活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。目前已用于临床的IFN有α、β、γ三种类型。近年来的研究发现，IFN还具有抗纤维化作用［3-4］。本研究发现，IFN α-2b滴眼液和原位凝胶均能够显著减少巩膜瓣下纤维结缔组织形成，并保持一定的滤过泡间隙。同时除术后第2周滴用IFNα-2b滴眼液组双眼眼压差异无统计学意义外，其余术后各时间点，实验眼IOP均显著小于自身对照眼。

既往IFN治疗青光眼滤过术后瘢痕化多采用结膜下注射或频繁滴眼的方法［5］。缓释给药系统可以延长药物在眼表的存留时间，提高药物的生物利用度，避免结膜下注射或频繁滴药给患者带来痛苦和不便。原位凝胶在凝固或凝胶形成之前是一种在室温下能够自由流动的液体，在体温环境下迅速变为凝胶［6］。本研究采用的温度敏感凝胶基质为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具有黏稠的流动液体行为，而在体温环境下能够转变为半固体透明凝胶，其透明性和半固体等特性使得它可以作为良好的眼部给药载体。本研究中使用的凝胶凝固温度为30℃，在眼部滞留时间20～30 min［7］，而普通滴眼剂在眼部存留时间为2～5 min。研究结果表明，温度敏感原位凝胶给药系统可以提高IFNα-2b在滤过术后的抗纤维化作用。虽然差异无统计学意义，但术后各时间点原位凝胶组兔眼IOP均低于滴眼液组兔眼IOP。这可能与原位凝胶延长了药物在眼表的停留时间，提高了生物利用度有关。

在本动物实验研究中，除眼部充血外，未发现IFN α-2b滴眼液和原位凝胶有明显的眼部不良反应。

综上所述，本研究表明，IFN α-2b在兔滤过手术模型中具有良好的抗瘢痕作用，原位凝胶给药系统可以进一步提高IFNα-2b的抗瘢痕作用。由于本实验仅是IFNα-2b原位凝胶给药系统的初步研究，IFN α-2b在眼部的药代动力学研究、理想的药物浓度和使用频率、在人眼的抗瘢痕效果等还有待于进一步的研究。

［1］Fourman S.Effects of aminoproprionitrile on glaucoma filter blebs in rabbits［J］.Ophthalmic Surg，1988，19(9):649-652.

［2］张秀兰，彭大伟，周文炳，等.干扰素α-2b与丝裂霉素C用于青光眼滤过术的临床对比研究［J］.中华眼科杂志，2000，36(2):119-123.

［3］Gillies M，Su T，Sarossy M.et al.Interferon-alpha 2b inhibits proliferation of human Tenon＇s capsule fibroblasts［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，1993，231(2):118-121.

［4］熊新春，杜蜀华，吕源淑，等.干扰素α-2b作为青光眼滤过术后辅助用药的实验研究［J］.中华眼科杂志，1999，35(1):52-54.

［5］张秀兰，彭大伟，曾淑君，等.干扰素α-2b与实验性滤过性手术［J］.中国实用眼科杂志，2000，18(1):26-28.

［6］Srividya B，Cardoza RM，Amin PD.Sustained ophthalmic delivery of ofloxacin from a pH triggered in situ gelling system［J］.J Control Release，2001，73(2-3):205-211.

［7］Wei G，Xu H，Ding PT，et al.Thermosetting gels with modulated gelation temperature for ophthalmic use:the rheological and gamma scintigraphic studies［J］.J Control Release，2002，83(1):65-74.