人钙离子激活的氯离子通道在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中表达的研究

王锋 王德辉

慢性鼻窦炎是鼻窦黏膜的一种慢性炎症性疾病，黏液髙分泌、杯状细胞增生、化生是其特征性病理变化。黏液的蛋白成分是黏蛋白，而鼻窦黏膜上皮主要分泌黏蛋白 MUC5AC，由杯状细胞产生。MUC5AC表达受多种炎性介质的影响，如白细胞介素(interleukin 4，IL-4)、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和中性粒细胞弹性蛋白酶等。在慢性鼻窦炎中，鼻窦黏膜上皮杯状细胞增生，MUC5AC表达上调［1］，但这些炎性介质调控MUC5AC表达的具体机制并不清楚。Ca2+激活的氯离子通道1(human calcium-activated chloride channel，hCLCA1，在鼠是 gob5)是近年来发现的新的跨膜氯离子通道家族成员。Nakanishi等［2］研究表明，哮喘大鼠的gob5在气道上皮杯状细胞选择性表达增加，气道上皮的杯状细胞数也明显增多，黏蛋白分泌、MUC5AC mRNA表达也随之增加。用表达hCLCA1基因的质粒转染NCI-H292细胞(一种人气道黏液上皮细胞系)，可直接引起MUC5AC表达增加和黏液细胞增殖活性增高［2］，提示 hCLCA1可能作为上游因子调节黏蛋白表达。在哮喘、慢性阻塞性肺病及肺囊性纤维化等下呼吸道疾病患者中［3-5］，hCLCA1的表达较健康人增高，表明hCLCA1与这些下呼吸道疾病的黏液髙分泌机制有关。但hCLCA1在慢性鼻窦炎的发病机制中是否发挥作用，目前还不清楚。本实验检测了hCLCA1在慢性鼻窦炎黏膜上皮的表达情况，探讨hCLCA1与慢性鼻窦炎的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 取2009年2～6月在我科行鼻内镜手术患者的筛窦黏膜(患者均知情同意)。慢性鼻窦炎不伴鼻息肉患者10例，其中男性4例、女性6例;年龄19～53岁，平均35.6岁。根据病史、体格检查、鼻窦CT扫描、鼻内镜，以及病理检查，患者均已诊断明确。所有患者均无变应性疾病及肺部伴发疾病。另取10例正常筛窦黏膜作为对照组，来自因外伤性视神经损伤、Grave眼病和脑脊液鼻漏而行鼻内镜手术的患者，其中男性6例、女性4例;年龄20～52岁，平均41.2岁。标本分两部分处理:一部分放入4%多聚甲醛过夜，用于免疫荧光实验;另一部分迅速放入液氮中，－80℃保存，用于定量mRNA检测。

免疫荧光用抗体包括羊抗人hCLCA1多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国);FITC标记兔抗羊IgG抗体(Zymed公司，美国)。Real-time试剂包括 Trizol(Invitrogen公司，美国)，Real-time用试剂盒(Fermentas公司)，定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪 (ABI 7300，Applied Biosystems公司，美国)，实时 PCR Master Mix(SYBR Green，Toyobo公司，日本)。荧光显微镜(DMR30型，Leica，德国)和冷冻切片机(CM3050 型，Leica，德国)。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光 标本常规处理，4%多聚甲醛固定，蔗糖脱水，冷冻包埋剂包埋;冷冻切片机下连续切片5张，层厚5 μm，室温干燥2 h后常规荧光染色;一抗4℃过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗后，二抗37℃孵育1 h，2种抗体工作浓度均为1∶100。以PBS代替一抗做阴性对照。封片后荧光显微镜拍照。所有拍照均在同一参数下完成。

1.2.2 实时定量PCR 按试剂盒说明进行。以Trizol试剂提取总RNA，取1 μg总RNA反转录合成cDNA第1链，采用SYBR Green绿荧光染料实时定量PCR检测hCLCA1 mRNA的表达，以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)做内参。引物序列如下:hCLCA1引物，上游5'CAATCGACTGAATCAAGCAG3';下游 5'CCACTGTTTATCTGTATGAG 3';GAPDH引物，上游 5'TGACTTCAACAGCGACACCCA3'，下 游 5'GTCCACCACC CTGTTGCTGTAG3'。反应在ABI 7300定量PCR仪上进行，PCR 反应总体系 25 μL，其中 2X RT mix 12.5 μL，cDNA(稀释 10 倍)1 μL，上、下游引物 5 pmol/μL，各1 μL，去离子水补足25 μL。反应条件:95 ℃ 5 min，45个循环;94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，55 ℃1 min，融解曲线，81个循环。

1.3 结果判断 在荧光显微镜下，观察鼻窦黏膜不同上皮细胞的荧光染色强度，分为强阳性(+++)、中度阳性(++)、弱阳性(+)及阴性(－)。计算每个高倍视野下阳性细胞面积与鼻窦黏膜上皮面积比:每个标本随机取1张切片，每个切片取10个高倍视野(×200)，通过荧光显微镜图像处理软件(Leica Qwin V3)计算每个高倍视野下阳性细胞与整个黏膜上皮的面积比，取平均值。2－△△Ct值表示基因相对表达量。

1.4 统计学处理 统计分析采用SPSS 13.0统计软件，各组阳性细胞面积比以表示，对各组均值进行两独立样本Mann-Whitney U检验。

2 结果

2.1 hCLCA1蛋白在鼻窦黏膜上皮中的表达hCLCA1表达于鼻窦黏膜上皮杯状细胞，慢性鼻窦炎组表现较强的荧光染色(+++)(附1页图1)，而正常鼻窦黏膜荧光染色呈弱阳性(+)或阴性(－)(附1页图2、表1)。慢性鼻窦炎组阳性细胞面积与黏膜上皮面积比为51.6% ±4.5%，对照组为7.2% ±5.1%，两组差异有统计学意义(P＜0.01)(表2)。阴性对照组中无阳性染色。

表1 hCLCA1在各组黏膜上皮细胞中的表达定位

表2 hCLCA1在各组阳性细胞面积比均值(n=10，高倍视野×200)

2.2 hCLCA1mRNA在各组鼻窦黏膜上皮中的表达

在慢性鼻窦炎组，鼻窦黏膜的hCLCA1 mRNA在鼻窦黏膜中呈高表达，在对照组表达水平较低，前者的平均表达水平是后者的49.7倍，两组差异有统计学意义(P ＜0.01，图3)。

图3.hCLCA1在慢性鼻窦炎组的表达与健康对照组比较＊示 P ＜0.01

3 讨论

慢性鼻窦炎是耳鼻喉科常见的慢性炎症性疾病，严重影响患者的生活质量。鼻腔、鼻窦黏液过度分泌是慢性鼻窦炎特征性病理改变之一。过度的黏液分泌引起患者大量流涕，加重鼻塞，更破坏了黏液-纤毛传输系统的功能，鼻腔、鼻窦黏膜防御功能减退，导致细菌更易定植，大量炎性介质积聚，炎症迁延不愈，因此，减少黏液分泌是治疗慢性鼻窦炎的重要方法。但是目前，炎症介质对慢性鼻窦中黏液分泌的调控机制并不清楚。

近年来，对下呼吸道的研究发现，hCLCA1在黏蛋白MUC5AC的表达中发挥作用，与呼吸道黏液分泌有着非常密切的关系。Hoshino等［6］的研究结果显示，hCLCA1存在于支气管上皮，主要是存在于分泌黏液的杯状细胞。体外和体内实验表明，IL-9、IL-13、TNF-α等通过上调hCLCA1介导MUC5AC的表达［7-9］。通过应用hCLCA1抑制剂能有效抑制炎症状态下呼吸道上皮杯状细胞MUC5AC的分泌［10-11］。上、下呼吸道黏膜的炎性反应同属一种病理生理机制且密切相关，提示hCLCA1在慢性鼻窦炎这类上呼吸道炎症性疾病的病理机制中可能同样发挥作用。因此本实验检测了hCLCA1在慢性鼻窦炎黏膜中的表达水平，探讨了其与慢性鼻窦炎的关系。

本实验免疫荧光结果显示，hCLCA1蛋白在慢性鼻窦炎的筛窦黏膜中表达明显增高，荧光染色强阳性，而健康对照组鼻窦黏膜中仅弱表达或无表达，荧光染色弱阳性或阴性。荧光染色半定量分析显示，慢性鼻窦炎组阳性细胞面积比高于健康对照组。进一步的定量RT-PCR研究表明，hCLCA1 mRNA在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中也呈高表达，是健康对照组的49.7倍，说明hCLCA1蛋白和基因在鼻窦黏膜中的表达水平是一致的。这一结果提示，hCLCA1在慢性鼻窦炎的病理机制中可能发挥重要作用。

对各组鼻窦黏膜中hCLCA1蛋白荧光染色进行分析，hCLCA1主要位于上皮杯状细胞，慢性鼻窦炎鼻窦黏膜细胞荧光染色呈强阳性，对照组染色呈弱阳性或阴性，而在上皮的其他细胞中未发现荧光染色，这与下呼吸道的研究结果一致［3，6］。结合慢性鼻窦炎病理形态特征，提示在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中hCLCA1的高表达可能与上皮杯状细胞增生及黏液高分泌有关。在体外培养的慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中，hCLCA1阻滞剂尼弗灭酸(NFA)对TNF-α诱导的MUC5AC表达具有抑制作用，提示hCLCA1在体外培养的慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中是 TNF-α诱导 MUC5AC表达的下游因素［12］。同样，在体外培养的慢性鼻窦炎鼻窦黏膜组织块中加入 Th2型细胞因子及 NFA，观察 NFA阻断hCLCA1对Th2型细胞因子诱导MUC5AC表达的影响，发现了同样结果［13］。这 2项研究结果提示，hCLCA1可能在慢性鼻窦炎或变应性鼻炎这类疾病中发挥同样作用，即调控MUC5AC的表达。但未检测hCLCA1在体内的表达情况。本实验从蛋白和基因水平对hCLCA1在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜的表达和分布情况进行了研究，2种实验结果证明，在慢性鼻窦炎中，hCLCA1的蛋白与基因表达均高于健康对照组的表达水平，提示hCLCA1可能在慢性鼻窦炎中的发病机制中发挥作用。

总之，通过本实验观察到，hCLCA1在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中有较强表达，其表达主要位于杯状细胞中，表明hCLCA1在慢性鼻窦炎上皮杯状细胞增生，黏液髙分泌的病理机制中可能具有重要意义，从而可能为治疗慢性鼻窦炎“黏液髙分泌”提供新的治疗靶点。

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