CD4+稳定自然杀伤T细胞在实验性变应性鼻炎发病中的作用

王凯 郑春泉

变应性鼻炎是一种常见病，其发病机制为传统的“Th1-Th2失衡理论”［1］，但目前还有很多现象无法解释。有证据表明，Th1-Th2反应失衡很可能仅为变应性疾病发病的冰山一角。自然杀伤T(natural killer T，NKT)细胞的发现，或许为深入探讨变应性疾病的发病机制提供方向。NKT细胞是一类特殊的细胞亚群，既表达T细胞的表面标志物，也表达NK细胞表面的一些特异性分子［2］。NKT细胞可迅速分泌大量具有免疫调节作用的细胞因子，如白细胞介素4(interleukin，IL-4)、γ 干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10 及IL-13。这些细胞因子可以调节体内的免疫反应。为进一步了解NKT细胞在变应性鼻炎发病中的作用，本研究采用免疫化学染色方法检测NKT细胞的标记物CD4+和NK 1.1，并应用流式细胞技术(flow cytometry，FCM)检测鼻腔黏膜中的CD4+iNKT细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6成年小鼠30只，雌雄不拘，体质量27～30 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，均排除鼻部疾病。

1.1.2 主要试剂与仪器 试剂:FITC抗小鼠CD4+(BioLegend，美国)、PE 抗小鼠 NK1.1(BioLegend，美国)。仪器:FCSCalib流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)，荧光显微镜(DMIRB，Leica，德国)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将30只小鼠随机分为变应性鼻炎组(A组)和健康对组照(B照)，每组15只。变应性鼻炎模型的制备方法为传统卵清白蛋白法［3］。

1.2.2 鼻部症状评分标准 1分:喷嚏1～3个，清涕流至前鼻孔，单前肢偶有挠鼻;2分:喷嚏4～10个，清涕超过前鼻孔，双前肢挠鼻;3分:喷嚏10个以上，清涕流至面部，不停到处擦鼻。≥5分为造模成功。

1.2.3 鼻黏膜组织学观察 制作石蜡切片并进行苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色，在显微镜下观察2组动物的鼻黏膜组织形态。

1.2.4 免疫酶标技术检测鼻腔黏膜中CD4+iNKT细胞浸润 取出标本并立即浸泡于4%多聚甲醛中，4℃冰箱放置24 h;脱钙液脱钙48 h;0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次;15%蔗糖浸泡6 h，30%蔗糖浸泡24 h;制作冷冻切片。室温下冷冻切片静置2 h至自然风干;PBS洗片5 min，共3次;滴 0.4%Triton X-100，37 ℃ 30 min;PBS洗片 5 min，共3次;山羊血清封闭液室温下封闭30 min;每张切片滴加 1∶50 FITC抗小鼠 CD4+30 μL，37℃孵育1 h;PBS洗片5 min，共3次;甘油封片;在荧光显微镜下观察。用PE抗小鼠NK1.1对NK1.1进行染色，步骤同CD4+染色。

1.2.5 FCM检测鼻腔黏膜中的CD4+iNKT细胞 将鼻腔黏膜块放入匀浆机样本槽内，加适量PBS处理2 min;打开样本槽，抽取组织匀浆;用200目细胞滤网过滤到冰预冷的试管内;离心、沉淀;300目细胞滤网过滤细胞块。细胞计数并调整细胞浓度为2×1010L－1，4℃保存待用。将悬液每份50 μL加入流式管中，加入50 μL PBS稀释的 FITC抗小鼠 CD4+、PE抗小鼠NK1.1，使其达到工作浓度，进行膜表面荧光标记，FCM检测。

1.3 统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理。计量资料用表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻部症状评分 A组所有动物评分≥5分，提示造模成功。A组症状评分为(7.3±1.0)分，B组症状评分为(0.7±0.6)分，A 组明显高于B 组(P ＜0.01)。

2.2 鼻黏膜组织形态 A组见纤毛结构大量脱落、组织水肿、小血管增生、黏膜上皮下固有层嗜酸性粒细胞(eosinophils，EOS)和淋巴细胞浸润(附1页图1)。B组见纤毛排列整齐，粗细均匀一致，无脱落、缺失现象，固有层未见明显EOS浸润(附1页图2)。

2.3 鼻黏膜中EOS计数 A组EOS计数为(7.5±1.2)个/HP，B 组为(0.4 ±0.5)个/HP，A 组明显高于B 组(P ＜0.01)。

2.4 免疫荧光染色 A组小鼠鼻腔黏膜中有大量被黄绿色荧光标记的CD4+细胞(附1页图3)和被红色荧光标记的NK1.1+细胞(附1页图4)浸润，主要集中在黏膜下层和固有层。将图3和图4进行叠加得到(附1页图5)，即被CD4+抗体标记的细胞绝大部分同时也被NK1.1抗体标记，而CD4+和NK1.1双阳性细胞即为CD4+iNKT细胞。由图可见变应性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜有大量CD4+iNKT细胞浸润。B组小鼠鼻腔黏膜中只见少量、散在的CD4+细胞存在(附1页图6)。

2.5 流式细胞检测 两组各7个标本中，CD4+和NK1.1双阳性细胞占 CD4+细胞的比例:A组为63% ～86%，平均 72.6% ±7.9%;B 组为 0.3% ～0.7%，平均0.49% ±0.1%，差异有统计学意义(P ＜0.01)，提示变应性鼻炎小鼠鼻腔黏膜中的CD4+细胞中，CD4+iNKT细胞占大多数(表1、图7)。

表1 两组样本的NKT细胞阳性率(CD4+iNKT细胞/CD4+细胞)分布情况(%)

3 讨论

NKT细胞既表达T细胞表面标志物，如T细胞受体、CD3等，也表达NK细胞表面的一些特异性分子，如 NKl.1(NKR-PIC)、CD161等。最初发现，NKT 细胞为一群表达NK细胞表面标记分子的T细胞，它们是CD4+或CD4－CD8－(DN)，其显著特征是CD1d限制，即可被CD1d呈递的糖脂类抗原激活，迅速分泌大量的IFN-γ和IL-4。随着研究的深入，发现NKT细胞在不同的情况下，分泌的细胞因子类型和数量及NKT细胞的细胞毒作用均存在很大差异。目前研究［4-5］表明，NKT细胞在抗感染免疫、抗肿瘤免疫，以及自身免疫性疾病的调节和移植免疫中均起到重要作用。Meyer等［6］发现，NKT细胞在变应性哮喘的发病中发挥非常关键的作用，其作用甚至超过CD4+T细胞，建议将NKT细胞作为变应性疾病治疗的靶细胞。本研究也表明，变应性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜中存在大量的NKT细胞浸润，数量远远超过CD4+T细胞。但是目前的观点仍认为，CD4+T细胞是主要浸润细胞，由其分泌的IL-4、IL-5及IL-13在整个变应性疾病的发病过程中起着重要作用［7］。

图7.A组流式细胞技术二维点图(左图):标本中存在大量的CD4和NK1.1双阳性细胞细胞，其数量远远超过CD4+细胞;B组流式细胞技术二维点图(右图):标本中CD4+细胞很少

对于变应性鼻炎的发病机制，目前比较一致的观点是“Th细胞平衡失调理论”。该理论认为，变应性鼻炎是体外环境因素作用于机体造成Thl和Th2免疫反应失衡，而引发的以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的变应性炎症。CD4+T细胞，即T辅助细胞及其相关的细胞因子产物，在变应性鼻炎的发生、发展中起着关键作用。IFN-γ和IL-4分别是Th1型和Th2型免疫反应的代表性细胞因子，而NKT细胞可以分泌IFN-γ和IL-4，因此NKT细胞也可能控制着变应性鼻炎的发病。与传统的观点不同，本研究采用荧光染色、FCM检测，证明在变应性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜中，有大量的CD4+iNKT细胞浸润，数量远远超过CD4+T细胞。所以我们认为，在变应性鼻炎的发病中，CD4+iNKT细胞发挥着重要的作用。至于其作用机制，本研究表明与IFN-γ和IL-4细胞因子有关，因为我们针对NKT细胞进行干预，发现NKT细胞通过控制IFN-γ和IL-4的分泌对变应性鼻炎的症状进行调控。基于NKT细胞在实验性变应性鼻炎的发病中扮演着重要角色，也许NKT细胞将会成为治疗变应性鼻炎很有前途的靶细胞。

［1］Bousquet J，Khaltaev N，Cruz AA，et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)2008 update［J］.Allergy，2008，63(Suppl 86):8-160.

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［3］赵秀杰，赵德荣.鼻超敏反应实验模型的建立［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28(1):17-18.

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［5］Miyamoto K，Miyake S，Yamamura T.A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells［J］.Nature，2001，413(6855):531-534.

［6］Meyer EH，Goya S，Akbari O，et al.Glycolipid activation of invariant T cell receptor+NKT cells is sufficient to induce airway hyperreactivity independent of conventional CD4+T cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(8):2782-2787.

［7］Cohn L，Elias JA，Chupp GL.Asthma:mechanisms of disease persistence and progression［J］.Annu Rev Immunol，2004，22:789-815.