响应面法优化桑黄产胞内多糖液体发酵培养基

谢丽源，谭 伟，郭 勇，贾定洪，彭卫红，甘炳成*

(四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

响应面法优化桑黄产胞内多糖液体发酵培养基

谢丽源，谭 伟，郭 勇，贾定洪，彭卫红，甘炳成*

(四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

利用响应面分析法对桑黄菌丝体生物量及产胞内多糖的液体发酵培养基进行优化，研究碳源、氮源、无机盐对桑黄菌丝生物量、胞内多糖含量及产量的影响。在单因素筛选试验的基础上，利用Box-Benhnken设计和响应面分析法对碳源、氮源和无机盐水平进行分析。结果表明，桑黄产胞内多糖的液体发酵培养基最佳组合为：玉米粉3.9%、麸皮2.2%、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.10%，在此条件下的验证实验表明，胞内多糖产量可达233.107mg/L。

桑黄；液体发酵；培养基；胞内多糖；响应面分析法

桑黄是担子菌亚门(B asid iomy cota)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、针层孔菌属(Phellinus)的真菌，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增强免疫等药理活性[1]。由于受自身生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，桑黄在自然界中形成子实体稀少，而且形成可用子实体需要多年，因此，通过野生环境获得桑黄子实体已不能满足需要。桑黄人工栽培技术开始应运而生，但是目前我国桑黄栽培的技术还不是很成熟，加之桑黄培养条件较为苛刻，生长周期长，这些因素使桑黄的开发和利用受到限制，使得桑黄难以成为稳定的工业产品来源[2]。因此，寻求人工培育的方法，研究以大量易得的菌丝体形式代替子实体已成为当务之急，采用液体发酵培养获得大量桑黄菌丝体或活性物质具有重要的意义[3]。

响应面分析法(RSM)是建立一个包括各因素的一次项、平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型，近年来日益受到重视[4-8]。该方法能对影响生物产量的因子水平及其交互作用进行优化与评价，从而快速确定最佳生产条件。在微生物发酵方面已有广泛应用，但在大型真菌发酵方面的应用不多[9-15]。本实验以菌丝体生物量和胞内多糖含量为响应值，采用单因素试验和响应面分析法对桑黄液体发酵培养基进行优化，为大规模利用这一珍稀大型真菌资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

桑黄(Phellinus baumii)菌种由四川省农业科学院微生物研究中心保藏。

种子培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，pH值自然，蒸馏水1L；液体种子培养基：葡萄糖30g/L、蛋白胨20g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，pH值自然；发酵优化用培养基：碳源筛选用基础培养基(各成分均为质量分数)：各种碳源3%、蛋白胨2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然；氮源筛选用基础培养基(各成分均为质量分数)：优选碳源3%、各种氮源2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然。

葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、硝酸铵、柠檬酸铵均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；LRH-250-Ⅱ生化培养箱 广东省医疗器械厂；HZP-250全温振荡培养箱、DZF-6020真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司； SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；R-201旋转蒸发仪、W201B恒温水浴锅 上海申胜生物技术有限公司；ALC-Z10.3电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；GLI66-Ⅱ高速离心机 上海安亭科学仪器厂； ZXZ旋片式真空泵 浙江黄岩求精真空泵厂；超纯水装置 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 菌丝平板培养

将灭过菌的基础培养基倒入无菌培养皿中制成平板，在无菌条件下，每平板中心接入1块直径5mm的活化菌种块，于28℃培养10d。

1.3.2 种子培养基制备

用打孔器从平板中打取6块直径5mm的活化菌种块，接入液体种子培养基中，于120r/min、25℃培养7d。

1.3.3 碳源筛选

以碳源筛选培养基为培养基质，分别以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、玉米粉、麦芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、土豆为碳源，接种10%液体种子培养基，500mL三角瓶中装液量为100mL，培养温度26℃，摇床转速120r/min，培养7d，测定菌丝体生物量及胞内多糖含量。

1.3.4 氮源筛选

以氮源筛选培养基为培养基质，分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、麸皮、硝酸铵、柠檬酸铵为氮源，接种10%液体种子培养基，500mL三角瓶装液量为100mL，培养温度26℃，摇床转速120r/min，培养7d，测定菌丝体生物量及胞内多糖含量。

1.3.5 最适碳源、氮源及无机盐质量分数的选择

分别对不同质量分数的碳源、氮源、K H2PO4、MgSO4·7H2O对菌丝体生物量及胞内多糖含量的影响进行研究，分别筛选出最适质量分数，并由此确定响应面试验优化范围。

1.3.6 响应面法优化培养基

在单因素筛选试验的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，进行四因素三水平的响应面分析，以菌丝体生物量及胞内多糖含量为响应值，研究各因素对菌丝体生物量及胞内多糖含量影响的显著性和各组分的最佳组合。

1.3.7 指标测定方法

菌丝体干质量测定：液体发酵液离心，取沉淀，蒸馏水洗涤，置65℃真空干燥至质量恒定，称质量。

胞内多糖含量测定：收集烘干菌丝体，粉碎，以料水比1:30(m/V)，于90℃热水中浸提4h，离心，将获得上清液用旋转蒸发仪浓缩，用3倍体积的95%乙醇沉淀过夜，离心，收集沉淀，于65℃烘箱烘干至质量恒定，称其质量。

胞内多糖产量＝胞内多糖含量×菌丝体干质量

1.3.8 数据处理

利用Design-Expert 7.0统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，再利用该软件中响应值优化程序求得当响应面值最大时的培养基各成分的最优水平。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基最适碳源的选择

图1 不同碳源对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.1 Effect of carbon source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

药用真菌可以利用多种碳水化合物，但对其利用程度有差异。由图1可知，不同碳源对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量均有较大的影响，不同碳源的培养基中菌丝体生物量由大到小依次为：玉米粉＞土豆＞葡萄糖＞糊精＞乳糖＞蔗糖＞麦芽糖＞可溶性淀粉＞甘露醇；胞内多糖含量从大到小依次为糊精＞可溶性淀粉＞甘露醇＞葡萄糖＞玉米粉＞土豆＞蔗糖＞麦芽糖＞乳糖；虽然玉米粉为碳源的胞内多糖含量稍低，但是由于生物量远高于其他碳源，因此从收集的目的产物胞内多糖产量看，以玉米粉为碳源的胞内多糖产量高于其他碳源，因此，选择玉米粉作为桑黄发酵产胞内多糖的碳源。

2.2 发酵培养基最适氮源的选择

图2 不同氮源对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.2 Effect of nitrogen source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

氮源是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料。由图2可看出，不同氮源对桑黄菌丝体及胞内多糖含量和产量均有明显差异，在以酵母粉为氮源的培养基中菌丝体生物量最大，从胞内多糖含量考虑，蛋白胨优于其他氮源，从胞内多糖产量角度分析，酵母粉为氮源时的胞内多糖产量最大，为206.865mg/L，稍高于麸皮204.493mg/L，但从生产实际考虑，麸皮价格低廉，容易获得，因此选择麸皮作为桑黄液体发酵培养基的氮源。

2.3 碳源、氮源及无机盐质量分数的选择

2.3.1 碳源质量分数的选择

图3 碳源质量分数对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.3 Effect of carbon source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由图3可知，当碳源即玉米粉质量分数为4%时，其菌丝体生物量、胞内多糖含量及胞内多糖产量均大于其他碳源，因此，确定碳源质量分数为4%。

2.3.2 氮源质量分数的选择

图4 氮源质量分数对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由图4可知，当氮源即麸皮质量分数为2%时菌丝体生物量最大，质量分数为3%时胞内多糖含量略大于2%，综合以上结果可知当麸皮质量分数为2%时桑黄菌丝体胞内多糖产量最大，由此确定氮源质量分数为2%。

2.3.3 KH2PO4和MgSO4·7H2O质量分数的选择

图5 KH2PO4质量分数对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.5 Effect of KH2PO4 concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

图6 MgSO4·7H2O质量分数对桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量的影响Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由图5、6可知，当KH2PO4和MgSO4·7H2O质量分数分别为0.2%和0.1%时可获得最大的胞内多糖产量，由此确定KH2PO4和MgSO4·7H2O质量分数分别为0.2%和0.1%。

2.4 响应面法优化培养基组成

2.4.1 试验设计与结果

综合单因素试验结果，选择玉米粉、麸皮、KH2PO4、MgSO4·7H2O 4个因素所确定的水平范围，用Design-Expert 7.0软件设计响应面试验，根据Box-Benhnken设计原理，以桑黄菌丝体生物量和胞内多糖含量为响应值，进行四因素三水平，共27个试验点的响应面分析，因素水平见表1。试验以随机次序进行，结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

表2 响应面优化试验Box-Benhnken设计及结果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

2.4.2 回归模型建立及方差分析

经Design-expert7.0软件对表2试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型。

以菌丝体生物量为目标函数的回归方程为：

以胞内多糖含量为目标函数的回归方程为：

表3 桑黄菌丝体生物量回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model for mycelium biomass

表4 桑黄菌丝体胞内多糖含量回归模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression model for intracellular polysaccharide production

由表3、4方差分析可知，以菌丝体生物量和胞内多糖含量为目标函数的回归方程的回归效果均为显著，P值均＜0.0001；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3、4中模型失拟项的P值分别为0.0945、0.1896均大于0.05，表明两模型的模型失拟项均不显著，说明这两个模型建立的回归方程能运用于桑黄液体发酵培养基优化的理论预测。

2.4.3 桑黄液体发酵培养基最适组合

通过软件分析，预测出最佳培养基水平编码值，即A=－0.027、B=0.178、C=0.051、D=0.095，相当于玉米粉为3.97%、麸皮为2.18%、KH2PO4为0.21%、MgSO4·7H2O为0.10%，在此条件下理论预测桑黄菌丝体生物量为14.2587g/L，胞内多糖含量为16.6395mg/g，由此可知，胞内多糖产量为237.2576mg/L。考虑到实际操作的方便，将各因子修正为：玉米粉为3.9%、麸皮为2.2%、KH2PO4为0.20%、MgSO4·7H2O为0.10%，在修正条件下进行验证实验，得到桑黄菌丝体生物量和胞内多糖含量分别为14.1366g/L、16.4896mg/g，由此得到胞内多糖产量为233.107mg/L。

3 讨论与结论

桑黄菌丝致密、有韧性，菌皮较厚，不易挑取，当接种至液体种子培养基时，菌丝不易分散，容易形成较大的菌球而不分散成小菌球，致使深层培养接种较为困难，因此，为了确保接种条件的均衡性，形成大小较均匀一致的菌球，要还当控制接种条件，使之培养的菌球分散均匀。

在碳、氮源筛选实验中，天然成分玉米粉作为碳源可明显促进桑黄菌丝生长；无机氮不能有效促进桑黄菌丝生长和胞内多糖的积累，而有机氮的使用，如酵母粉、蛋白胨和牛肉膏能明显促进桑黄菌丝生长，麸皮作为一种天然成分对桑黄菌丝生长也有促进作用，其促进效果与有机氮源相当；作为碳源和氮源的玉米粉、麸皮价格低廉，也比较易得，非常适合大规模工业化生产。但是，玉米粉和麸皮的用量要控制好，否则在制作培养基时过滤比较麻烦。

采用响应面法优化桑黄液体发酵培养基配方，分别拟合以菌丝体生物量与胞内多糖为目标函数的回归方程，其结果表明桑黄在低氮源、高碳源组合时，即当玉米粉为3.9%、麸皮为2.2%、KH2PO4为0.20%、MgSO4· 7H2O为0.10%时，桑黄菌丝体生物量及胞内多糖含量和产量均为较理想，说明用响应面法寻求同时获得最佳菌丝体生物量和胞内多糖含量的方法是切实可行的。

[1]张小青, 戴玉成. 中国真菌志[M]. 北京: 科学出版社, 2005: 117-191.

[2]赵子高, 杨炎, 刘艳芳, 等. 药用真菌桑黄液体深层发酵条件的优化[J]. 微生物学通报, 2007, 34(3): 459-462.

[3]LIN E S, CHEN Y H. Factors affecting mycelial biomass and exopolysaccharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(13): 2511-2517.

[4]刘丽丽, 张建新, 王娜, 等. 响应面分析法优化光皮木瓜总酚醇提工艺的研究[J]. 中国酿造, 2009(2): 76-79.

[5]凌庆枝, 高莉莉, 袁怀波, 等. 用响应面分析法优化桑叶水溶性多糖得提取工艺[J]. 蚕业科学, 2009, 35(3): 666-670.

[6]刘云, 胡芳, 王志成, 等. 响应面分析法优化油菜籽类胡萝卜素的提取工艺[J]. 食品科技, 2009, 34(12): 108-112.

[7]王灵昭, 邓家权. 微波法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2007, 128(12): 96-100.

[8]刘军海, 黄宝旭, 蒋德超. 响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(2): 114-118.

[9]吕国英, 张作法, 潘慧娟, 等. 响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基[J]. 菌物学报, 2010, 29(1): 106-112.

[10]王允祥, 吕凤霞, 陆兆新. 杯伞发酵培养基的响应曲面法优化研究[J]. 南京农业大学学报, 2004, 27(3): 89-94.

[11]熊智强, 徐平, 涂国全. 利用响应面法优化红谷霉素发酵培养基[J].微生物学通报, 2006, 33(4): 5-9.

[12]朱会霞, 孙金旭. Nisin液体发酵工艺条件的响应面分析优化[J]. 中国乳品工业, 2009, 37(8): 31-43.

[13]余杰, 崔鹏举, 卓健勇, 等. 响应面分析方法在鸡腿菇多糖提取中的应用[J]. 食品科学, 2009, 30(8): 93-96.

[14]杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 68-71.

[15]李春英, 李晓娟, 杨磊, 等. 响应面分析法优化甘草酸和甘草黄酮联合提取工艺[J]. 黑龙江大学自然科学学报, 2009, 26(3): 390-395.

Application of Response Surface Methodology for Optimization of Liquid Fermentation Medium for Intracellular Polysaccharide Production by Phellinus baumii

XIE Li-yuan，TAN Wei， GUO Yong，JIA Ding-hong，PENG Wei-hong，GAN Bing-cheng* (Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing intracellular polysaccharide by Phellinus baumii by response surface methodology. The effects of carbon source, nitrogen source, and metal ions on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production were explored in single factor experiments, and corn flour and wheat bran were found to be the best carbon source and nitrogen source, respectively. Based on this, the optimum levels of corn flour, wheat bran, KH2PO4 and MgSO4 were determined by Box-Benhnken design combined with response surface analysis to be 3.9%, 2.2%, 0.20% and 0.10%, respectively. The intracellular polysaccharide production in optimized medium reached 233.107 mg/L.

Phellinus baumii；liquid-state fermentation；culture medium；intracellular polysaccharide；response surface methodology

TQ920.1

A

1002-6630(2011)07-0224-05

2010-06-08

四川省青年基金项目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撑计划项目(2008FZ0157)

谢丽源(1977－)，女，助理研究员，博士，研究方向为农产品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：甘炳成(1968－)，男，研究员，硕士，研究方向为微生物及农产品加工。E-mail：bgan918@sohu.com