pH影响七彩神仙鱼蛋白酶活性的研究

郑育宏

（惠州博罗中等专业学校，广东 惠州 516100）

pH影响七彩神仙鱼蛋白酶活性的研究

郑育宏

（惠州博罗中等专业学校，广东 惠州 516100）

PH是影响蛋白酶活性显著因素之一。本人采用Folin—pHenol试剂法，以酪蛋白为底物，测定了七彩神仙鱼胃、中肠、后肠等组织蛋白酶活性、最适PH值，初步探讨了PH对七彩神仙鱼胃、中肠、后肠蛋白酶的影响。试验结果表明，胃蛋白酶PH在2.0，此时酶比活力为127.8；而中肠蛋白酶最适PH为7.8，最高酶活力比为62.5；后肠最适PH为7.8，最高酶比活力为59.6。另外，胃蛋白酶活性显著高于肠的蛋白酶活性。本文可为研究优化观赏鱼的养殖技术提供参考。

七彩神仙鱼；PH；蛋白酶；活性

七彩神仙鱼（SympHysodon discus）俗称铁饼、七彩燕，属慈鲷科（Cichidae）鱼类，是名贵的热带观赏鱼之一，它原产地为南美洲的亚马逊河流域。因其体态雍容华丽及独特的护幼和抚育行为，倍受观赏鱼爱好者的青睐，被冠为“热带观赏鱼之帝”。但七彩神仙鱼难于养殖，尤其在苗种阶段，人工饲料满足不了其需求。有关于七彩神仙鱼生物学特性、养殖和繁殖技术的研究已有一些报道，但关于七彩神仙鱼营养和生理生态方面，饲料对七彩仙鱼生长、消化吸收影响的研究报道少见。消化酶活性与环境因素有密切关系，其中PH是主要影响因素，笔者对七彩神仙鱼的蛋白酶活性进行了系列研究，期望在七彩神仙鱼饲养过程中对饵料选择、配合饵料的研制等方面有所帮助，提高七彩神仙鱼的成活率，可为研究优化观赏鱼的养殖技术提供参考。

1 .材料与方法

1.1 材料与样品制备

试验用的七彩神仙鱼淡水养殖，均健康无害。平均体全长12cm，体重为51.6g，取回后在水族箱暂养，饥饿24小时后，取鱼称重解剖，取出胃、肠（实验时分中肠和后肠），剔除附属物，剖开胃、肠，用冷却去离子水（4℃）冲洗，滤纸吸干，称重，按样品重的20倍分次加进约pH＝7.0的冷却去离子水，高速捣匀，用冷冻离心机经4000 r/min离心30 min，取上清液于4℃冰箱保藏备用，12小时内分析完毕。

1.2 标准曲线的绘制

取试管6支，标号0、1、2、3、4、5。分别向6支试管中加入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00标准酪氨酸溶液（50μg/ml）。然后，各试管用蒸馏水补足到1.00 ml，再各加0.55M碳酸钠溶液5 ml，最后各管依次加入福林－酚试剂0.5 ml，摇匀，置30℃恒温水浴显色15分钟，用722型分光光度计在680 nm处测光吸收值。以酪蛋白的微克数为横坐标，以吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

图1 酪蛋白标准曲线

表1 酪蛋白标准曲线

1.3 蛋白酶活性测定

蛋白酶活性的测定采用福林－酚试剂法。先作实验组：用0.5%酪蛋白溶液2 ml为底物（保持缓冲PH值为7.5），在30℃恒温水浴中预热5分钟后加入预热（30℃，5分钟）的酶液1 ml，缓冲液2 ml，立即计时。反应10分钟后，由水浴中取出，并立即加入10%的三氯乙酸溶液3 ml，放置15分钟后，用滤纸过滤，取滤液1 ml。加入0.55 mol/L碳酸钠5 ml，再加入福林－酚试剂1 ml，30℃水浴中显色15 min。另外，同时做空白对照：先取0.5%酪蛋白溶液2 ml，缓冲液2 ml，先加入3 ml10%的三氯乙酸溶液，然后再加入酶液1 ml，以下操作同试验组。用722型分光光度计，在波长为680 nm条件下测定各自的光密度值。

在资料中显示，胃蛋白酶最适PH测定为1.5～6.5，所以对胃蛋白酶的测定时，只测定PH为2.2～6.2时的活性，设置了11个梯度；而肠蛋白酶在PH4.5～8.5，所以设置了9个梯度，测定范围为4.6～7.8的活性。

1.4 蛋白酶比活力定义

蛋白酶活力单位：在 30℃水浴下，粗酶液每毫克蛋白每分钟水解所产生酪氨酸的毫克数。

式中：△O.D为样品管光密度值——空白管光密度值

ε为每个样品管中蛋白的用量（毫克）

t为保温时间（分钟）

2 .结果

以PH值为2.0～8.0的0.2 mol/L磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液分别测定胃、肠组织蛋白酶最适PH值，并测定各组织在不同 PH条件下蛋白酶的活性。所得数据用 Excel及SPSS软件进行处理。

表2 PH对胃、肠蛋白酶活性的影响

图2 PH对七彩神仙鱼蛋白酶活性的影响

3 .分析与讨论

3.1 蛋白酶的分布特点

根据表2可得，七彩神仙鱼的胃蛋白酶活性的最适PH值为2.2，此时它最高酶比活力为127.8；中肠蛋白酶活性的最适PH值为7.8，此时它最高比活力为62.5；而后肠蛋白酶活性的最适PH值为7.8，此时它最高比活力为59.6。综合上面的结果，可以看出胃组织蛋白酶活力显著高于肠组织蛋白酶活力。这一分布特点说明饲料蛋白质的消化主要集中于胃。肠也有一些消化功能，但相对于胃而言，比较弱，作用还是次要的。由此可得，胃蛋白酶在饲料蛋白质的消化吸收过程中起较大作用，这一结果与有胃鱼消化特性相似。这样，如何让蛋白质饲料停留在胃中的时间延长，让鱼类能充分地消化食物中的蛋白质，提高饲料的利用率，才能节省饲料成本，提高鱼的生长发育速度。

鱼类消化器官组织的结构和消化机能是与其的食性相适应的，消化器官的不同部位，因其所承担的消化机能不同，其消化酶活性也就会呈现明显的差异。消化系统中不同部位蛋白酶活性的最适PH也就会呈现不同值。七彩神仙鱼胃蛋白酶活性中2.2以下最强，在中性和碱性下则失活，这一结果与尾崎久雄等报道基本一致，中、后肠蛋白酶最适PH值大致在7.8，偏弱碱性，这与许多有胃鱼，如大鳞大麻哈鱼、莫桑比克罗非鱼、暗纹东方豚的肠蛋白酶最适PH为7.0～9.5是相同的，也与肠道内是经常保持碱性的相一致。而七彩神仙鱼肠蛋白酶在弱酸性的条件，并未失活，比活力不大。

3.2 蛋白酶活性鱼消化器官内PH相适应

实验结果现实，七彩神仙鱼蛋白酶的最适PH在2.2以下，肠为7.8，这些消化器官的蛋白酶最适PH与鱼体消化器官内部环境是相适应的。如动物体内胃为酸性，而肠液一般为碱性。各组织相应的蛋白酶最适PH值都处于相对应的PH范围中，这有利于充分发挥蛋白酶的作用。

鱼的消化道不同部位上的特定环境，是导致七彩神仙鱼胃、肠蛋白酶活性最适PH差异和适应PH范围较窄的原因，也是有胃鱼的共同特点。七彩神仙鱼的中肠蛋白酶比后肠蛋白酶活性稍高，这可能是由于中肠接近胃的缘故。但胃蛋白酶活性明显高于肠蛋白酶活性，这一结果与尼罗罗非鱼相同，这一结果进一步证明胃可能就是七彩神仙鱼消化蛋白质的主要组织，另一方面，也反映了胃组织蛋白酶可能在饲料蛋白质消化上发挥更重要的作用。

3.3 蛋白酶活性鱼食性的关系

七彩神仙鱼蛋白酶最高比活力为127.8，处于一个比较高的水平。不同食性的鱼类，其蛋白酶活性差异比较大，但它们之间存在一个明显的规律性，即杂食性鱼类高于虑食性鱼类，虑食性鱼类又高于草食性鱼类。一般来说七彩神仙鱼是个杂食鱼种，但它对饲料也是非常挑剔的，一般的干饲料是不太能吸引七彩神仙鱼索食，现在一般而言喂食的饲料是红虫、丰年虾和牛心汉堡，而最吸引七彩神仙鱼的是红虫。这就体现了七彩神仙鱼，对饲料蛋白质水平要求稍高，其蛋白酶活性比虑食性、草食性的鱼类要高，是与这一点相适应的。

另外鱼类蛋白酶活性与饵料更密切，随饲料中蛋白质的增多而相应鱼体中的蛋白酶也相应会增多，黄耀桐等指出，如果在饲料中蛋白质增加在32%～40%范围内，肠蛋白酶活性都将随饲料中蛋白质含量的增高而升高。

由于食性的不同，消化道的构造差异很大。七彩神仙鱼的消化系统比较简单，胃很小，肠道比较细长，这影响了蛋白酶的数量。若以胃蛋白酶比活力为100%，则中肠蛋白酶比活力为48.90%，后肠蛋白酶比活力为46.63%。这些数据证明，胃蛋白酶活力比肠蛋白酶活力明显要高，这与其体内消化器官结构和生理特点相适应的。

3.4 底物与蛋白酶活性的关系

七彩神仙鱼的消化组织蛋白酶的最适PH是以酪蛋白为底物测定的，反映了酪蛋白与组织消化酶活力的关系，但饲料蛋白质来源于很多种，这些蛋白质如何影响酶活力需作进一步研究。研究七彩神仙鱼蛋白酶的活性，可作为日粮蛋白质需要的参考依据。

4 .小结

七彩神仙鱼不同消化器官各自所适应的PH差异很大，胃内为强酸环境，肠内为弱碱性环境，这是有胃鱼的共同特点，而试验结果为，胃蛋白酶的最适PH在2.2以下，此时酶比活力为127.8；肠蛋白酶的最适PH为7.8，其中中肠最高酶比活力为62.5，后肠最高酶比活力为59.6。而中肠、后肠的酶比活力稍微有点差异，但差异不大。

[1] 施振宁，吴美仙，陈亚琴. 七彩神仙鱼的生物学特性研究[J].水利渔业，2003，4.

[2] 殷宁，赵强，李朝晖，赵清良.暗纹东方豚蛋白酶活性的研究[J]. 南方师大报（自然科学报），2001，1.

[3] 苏锦祥.鱼类学与海水鱼类养殖（第二版）[M].中国农业出版社，2000.

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1008-7427（2011）07-0158-02

2011-04-05