生物法测发酵液中红谷霉素效价

何 建，阮彩彪，涂晓嵘，涂国全

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045)

生物法测发酵液中红谷霉素效价

何 建，阮彩彪，涂晓嵘，涂国全*

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045)

目的:建立检测红谷霉素效价的方法。方法:采用生物量法，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过测定稳定指示菌菌悬液浓度及细菌培养基厚度参数，得到以红谷霉素标准液浓度的对数值为纵坐标，其抑菌圈直径的平方为横坐标的标准曲线。结果:得到标准曲线方程为:y=0.0031x－0.7935，R2=0.9946。结论:对生物法测抗生素效价主要影响因素量化并稳定控制后，得到重复性好的生物法测发酵液中红谷霉素效价的检测方法。

红谷霉素，生物法检测，效价

从土壤中分类筛选到一株链霉菌，简称链霉菌702，其所产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性，从该菌的发酵产物分离提取和纯化其抗细菌活性物质，经红外、质谱和核磁共振谱测定结果表明，该活性物质与放线菌素X2(ActinomycinX2)同质，命名为红谷霉素(Honggumycin)［1－4］。在抗生素检测中，生物法由于各参数不利于控制，所以重复性较差，但此法方便、直观、花费少，所以在估测发酵液中抗生素效价时常被采用［5－7］。本文对生物法检测发酵液中新农抗702效价进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

抗生素 红谷霉素(99.47%)，本实验室提供;检测菌种 金黄色葡萄球菌;检测培养基 细菌培养基;发酵液 链霉菌702发酵液，本实验室制备。

722可见光分光光度计 上海光谱精密仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 检测菌悬液的制备 将连续活化1～2次的检测菌接种于细菌斜面培养基上，37℃恒温培养箱培养18～24h。之后用适量无菌水将斜面上的菌洗脱下来，充分摇匀，作为指示菌菌悬液备用。

1.2.2 指示菌菌悬液计数 光电比浊法，平皿计数［8］。采用梯度系数法将指示菌菌悬液稀释不同倍数，用722分光光度计在660nm处测不同稀释度的菌悬液透光度值，同时将不同稀释度的菌悬液稀释涂布平板，37℃培养24h后计数。

1.2.3 双层检测平板的制备 取(10mL)灭菌细菌培养基加热融化后倒入90mm的无菌平皿中，水平静置待其凝固，作为底层;另取灭菌细菌培养基，待其冷却至50～60℃时，向其加入检测菌悬液(培养基与菌悬液体积比为1∶20)，振荡摇匀后取(10mL)迅速倒入已铺好底层的平皿中，水平静置待其凝固，作为菌层。

1.2.4 标准溶液的制备 准确称取5.0266μg红谷霉素(99.47%)粉末，加入50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，用无菌水定容至50mL，配成100μg/mL红谷霉素标准溶液。

1.2.5 牛津杯的放置 本实验中所用牛津杯为不锈钢圆筒，内径6mm，外径8mm，高10mm。待制备好的双层平板静置15min后，用灭过菌的镊子在平板上等距离均匀放置6个牛津杯，滴加样品及待测溶液。

1.2.6 样品及标准溶液的注入 取标准品和待测品滴加于牛津杯中(295μL/个)，一皿中不同剂量的同一标准品和待测品各滴加2个牛津杯，每个皿中滴加2个牛津杯用于校正的中心浓度标准品。加样后将平板水平放入到37℃培养箱中培养20～24h。

表2 红谷霉素标准品效价测定结果

1.2.7 标准曲线的测定与绘制 培养20～24h后，将平板从培养箱中取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并通过中心浓度校正后，以抑菌圈直径的平方为横坐标，红谷霉素浓度(浓度单位为μg/mL)的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。将待测品抑菌圈直径代入标准曲线即可求出待测样品的效价。

2 结果与讨论

2.1 管碟扩散法基本参数的确定

培养基厚度∶确定为在直径90mm的培养皿中总加入20mL培养基时的厚度。培养基过少则培养基容易干裂，过多则使得培养皿皿盖接触到抗菌液。

指示菌菌悬液浓度∶比较敏感菌菌悬液不同浓度(用可见分光光度计在660nm处测其透光度值)所制得的双层检测平板的抑菌效果，如图1、表1所示，指示菌浓度为106个/mL时，金黄色葡萄球菌浓度较稀松，抑菌圈边缘模糊，不易于观察测量;指示菌金黄色葡萄球菌浓度为108个/mL时，指示菌浓度过密，同样浓度红谷霉素产生的抑菌圈相对较小，不利于区分浓度较接近的发酵液产生的抑菌圈，容易产生误差;指示菌浓度为107个/mL时，金黄色葡萄球菌生长良好，浓度适宜，抑菌圈圆整性较好，边缘清晰，最有利于观察和测量。因此，确定敏感菌液浓度为107个/mL。以1∶20比例加入指示菌培养基中所制备的双层检测平板，在37℃条件下培养20～24h。

图1 不同指示菌浓度抑菌效果

表1 不同指示菌浓度时的抑菌效果

2.2 标准曲线的测定与绘制

对检测方法中各项参数量化并稳定控制后，红谷霉素含量仅是抑菌圈直径的一次函数。测定结果如表2所示，实验结果均为三次实验平均值。

根据效价测定结果，以抑菌圈直径的平方为横坐标，红谷霉素浓度(浓度单位为μg/mL)的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。

图2 一剂量管碟法测红谷霉素标准曲线

由图 2可知，在红谷霉素质量浓度为 0.5～6.5μg/mL时，抑菌圈直径的平方与红谷霉素标准品浓度的对数值呈良好的线性关系，其方程为y= 0.0031x－0.7935，R2=0.9946。这种检测方法的最小检测浓度为0.5μg/mL，最大检测浓度为6.5μg/mL。

2.3 发酵液中红谷霉素效价检测

利用生物量法检测3批摇瓶发酵液中红谷霉素效价，分别测得红谷霉素质量浓度为∶1.85、1.879、1.888g/L。

2.4 讨论

抗生素效价检测方法较多，其中生物法较为直观，操作也不复杂，且不需要高设备投资，但其受操作等因素影响。本实验对主要影响因素指示菌培养基厚度、指示菌浓度进行量化。指示菌培养基厚度∶底层10mm、上层10mm;指示菌菌悬液浓度∶采用107个/mL(在660nm处其透光度值42%进行控制)。

3 结论

生物法测红谷霉素效价，以金黄色葡萄球菌为指示菌，得到红谷霉素效价单位在0.5～6.5μg/mL时其抑菌圈直径标准曲线，曲线相关性好，能较准确地估测出发酵液中红谷霉素效价，且重复性好。

［1］李昆太，黎循航，涂国全，等.702生物防腐剂对细菌、霉菌和酵母菌类抑菌效果的初步测定［J］.江西农业大学学报，2002，24(5):599－601.

［2］黎循航，刘姝，涂国全，等.链霉菌702所产生物活性物质抑菌活性的初步研究［J］.江西农业大学学报，2002，24(6): 829－832.

［3］魏赛金，钟敏，黄林，等.链霉菌702所产抗细菌组分S2的分离纯化［J］.江西农业大学学报，2006，28(3):453－457.

［4］钟敏，孙宇辉，涂国全，等.链霉菌702所产抗细菌组分S2的化学结构鉴定［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2007，36(3):307－311.

［5］蒋克海.管碟法效价测定中实验结果的影响因素及有效控制［J］.安徽医药，2007，11(1):17－18.

［6］舒畅，韩立，崔清兰，等.浅谈抗生素管碟测定法的操作要点［J］.河南畜牧兽医，2007，28(5):39－40.

［7］黄镜娟.管碟法测定抗生素效价结果的影响因素分析［J］.现代医药卫生，2006，22(18):2853－2854.

［8］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.北京:高等教育出版社，1999:95－96.

Study on determination of Honggumycin potency in fermentation by biological method

HE Jian，RUAN Cai－biao，TU Xiao－rong，TU Guo－quan*
(Biological Science and Engineering College of Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045，China)

Objective:To establish a method of test Honggumycin potency.Methods:Using biomass method，taking Staphylococcus aureus as the indicator bacteria，determining stability the parameter of indicator bacteria concentrations and bacterial suspension medium thickness.The standard curve by the concentration of standard Honggumycin as the vertical axis，inhibition zone diameter square as abscissa was obtained.Results:The standard curve equation:y=0.0031x－0.7935，R2=0.9946.Conclusion:After stability control and quantization of the main factors，reproducible test method of Honggumycin potency by biological fermentation was obtained.

Honggumycin;biological method test;potency

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0441－02

2010－09－06 *通讯联系人

何建(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:微生物学。

江西省科技支撑计划项目(2009BNA07200)。