一株细菌型豆豉发酵菌种的筛选及鉴定

李小永，陈 伟，程 芳，李 靖

(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018)

一株细菌型豆豉发酵菌种的筛选及鉴定

李小永，陈 伟*，程 芳，李 靖

(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018)

从临沂细菌型豆豉中筛选出一株适于豆豉生产的高产蛋白酶菌种，并对此菌种进行鉴定。结果表明:采用酪蛋白平板初筛，制曲复筛，根据曲样蛋白酶酶活以及游离态含量共选出5株优良菌株用于豆豉的制作，由成品豆豉的理化指标和感官评定认为D2号菌种发酵的豆豉风味好，滋味鲜美。结合生理生化和16S rDNA序列分析初步鉴定D2号菌种为枯草芽孢杆菌，该菌株来源于豆豉，属于安全菌种，具有研究开发价值。

细菌型豆豉，分离，鉴定，16S rDNA

豆豉起源于我国，它是以黄豆和黑豆为原料，经微生物发酵而制成的传统发酵食品，按制曲发酵时参与的主要微生物种类的不同，豆豉分为米曲霉型、根霉型、毛霉型、细菌型以及脉胞菌型五大类产品［1］，其中山东临沂的八宝豆豉就是细菌型豆豉的典型代表，此外在云南、四川、贵州等省民间也有细菌型豆豉的制作。国外细菌型豆豉以日本的纳豆最为出名，严格来说纳豆源于我国细菌型豆豉，是我国细菌型豆豉的孪生姐妹。用蛋白酶产生菌进行豆豉的制作，微生物产生的胞外蛋白酶可直接作用于大豆蛋白，将大分子蛋白质水解成小分子肽类以及游离态氨基酸，这些物质不仅易为人体消化吸收，还具有很强的生物活性，并且对豆豉的风味也有很大的影响，这对功能性豆豉食品的研制十分有利，目前日本流行的功能性食品纳豆就是利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus stubtilis natto)为主要发酵剂生产的，因该菌能产纳豆激酶(Nattokinase，NK)，一种丝氨酸蛋白酶［2］，并且有很强的溶栓活性，受到了广泛的关注，而我国细菌型豆豉还没有明确的发酵菌种，这导致了我国细菌型豆豉的生产规模以及制作工艺都受到很大程度的限制。目前我国豆豉的生产仍是以传统的自然发酵为主，由于菌种没有明确的分离鉴定，尚未制作成发酵剂，另外在民间制作发酵过程中各项条件难以控制，存在着安全隐患［3］。结合以上问题，以临沂八宝豆豉为原料，通过酪蛋白初筛，制曲复筛筛选出高产蛋白酶菌种，并进一步制作豆豉，筛选出适于豆豉生产的高产蛋白酶菌种，并对其进行生理生化鉴定，同时结合16S rDNA对该优良菌种进行鉴定，旨在筛选出适合豆豉生产的优良菌种。

1 材料与方法

1.1 实验材料

沂蒙特产八宝豆豉 临沂惟一斋酱园生产，购于泰安银座超市;黑豆 购买于泰安中百商城;干酪素、酪氨酸，DNA marker，琼脂糖以及其它电泳试剂

均为生化试剂;细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天跟公司;活化、保存菌种培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基;初筛培养基 酪蛋白琼脂培养基［4］;产芽孢培养基［5］肉汤培养基100mL，玉米粉5g，酵母膏0.5～1g，pH 7.2～7.4。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌型豆豉中产蛋白酶菌种的初筛 无菌操作取25g豆豉加入到含有225mL无菌生理盐水的摇瓶中，在摇床上200r/min分散10min，得到稀释10倍的菌液，再依次用生理盐水稀释得到稀释倍数为105～107的菌液。分别取稀释倍数为105～107的菌液100μL均匀涂布于酪蛋白培养基上，每个稀释度做三个重复。37℃培养48h后观察有透明圈菌落的形态、挑取有透明圈的菌落并将其反复划线于酪蛋白琼脂平板培养基上，直至分离成单菌落后将菌种接种在牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上于4℃下保存。然后用梯度稀释法将菌液涂布在酪蛋白培养基上面，37℃培养48h后测量透明圈直径与菌落直径的比值。

1.2.2 菌种活化 挑取一环斜面上面的菌种接种在活化液体培养基里，37℃摇瓶培养24h后保存在4℃。采用稀释平板法计数。

1.2.3 细菌型豆豉中产蛋白酶菌种的复筛 将从市场购买的黑豆用三倍体积的水浸泡24h，将黑豆取出沥干，将黑豆放于烧杯中，烧杯上包八层纱布，并用报纸包好，121℃灭菌25min，灭菌后，待黑豆温度降至40℃左右后按每100g接种2mL 108cfu/mL的菌液量将菌液在无菌条件下接种于黑豆中，混匀。37℃培养，每24h测一次蛋白酶活性，连续测定96h，从中筛选出蛋白酶活性较高的菌株。

1.2.4 蛋白酶酶活的测定 粗酶液的制备∶取10g曲样室温下研磨，然后加入60mL磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤，将洗涤液装入 150mL三角瓶中，30℃，160r/min条件下摇床振荡30min，然后用四层纱布过滤，滤液经抽滤后取5mL于50mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容摇匀，即为粗酶液。蛋白酶酶活的测定∶采用紫外分光光度法［6］。

1.2.5 氨基态氮的测定 采用甲醛滴定法测定［7］。

1.2.6 豆豉制作工艺［8］黑豆→清洗→浸泡→高压蒸煮→冷却→接种→制曲→洗曲→拌盐后酵→干燥→豆豉

前处理以及制曲同1.2.1，制曲72h后洗曲加盐10%于45℃后酵15d，50℃条件下干燥。

1.2.7 豆豉主要成分分析 水分、粗蛋白质、游离氨基态氮、总酸、脂肪以及灰分的测定参见文献［9］。总氮用凯氏定氮法测定。

1.2.8 豆豉感官评定标准［10］根据豆豉的色、香、味、体设计相关的评定标准，对制作后的豆豉由10名食品学院研究生进行感官评定及打分，评定标准见表1。

表1 豆豉感官评定标准

1.2.9 菌种鉴定 菌体形态学和生理生化实验∶菌体形态特征和生理生化特征参照文献［11－13］中的方法。分子生物学(16S rDNA)鉴定∶细菌总DNA提取以及方法参考细菌基因组DNA提取试剂盒上面的说明进行。

16S rDNA的通用引物由上海博尚生物技术有限公司合成∶

上游引物 P1∶5'－AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT－3';

下游引物P2∶5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC－3'。

PCR扩增的反应条件为∶95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行35个循环，最后72℃保温10min，反应后取5μL产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。将PCR扩增产物纯化后送华大测序公司进行测序。

测序结果在GenBank中注册并通过Blast进行同源序列检索，并用 MEGA5.0软件采用邻接法(Neighbor－Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建。重复取样1000次进行自展值(bootstrap value)分析，以评估系统发育树的置信度。

2 结果与分析

2.1 细菌型豆豉高产蛋白菌种的筛选

2.1.1 初筛结果 将梯度稀释后的纯菌种接种在酪蛋白培养基上面，37℃培养24h以观察其透明圈大小，结果表明在接种的45株菌种中，共有30株形成可见的透明圈，根据透明圈直径和菌落直径比值的大小，共有10株透明圈直径与菌落直径比值大于3的菌种(表2)，选取该10株菌株进行复筛。

表2 高产蛋白酶菌株的初筛

2.1.2 复筛结果 对选取的10株菌种进行豆豉制曲复筛，每隔24h测定一次酶活以及游离态氮，连续测定4d，由图1可以看出，在72h内各个菌种制曲产生的蛋白酶酶活随制曲时间的延长除D1和D13号菌种外均显著上升，其中72h的酶活除D1和D13号菌种外均处于最高水平，而96h时各个曲样的蛋白酶酶活均显著下降，该时期的曲样略有氨味，说明该时期早已完成前发酵阶段，若以该时期的曲样进行豆豉制作，所得的产品味道发苦，酱香不足，氨味较浓。制曲期间菌种利用黑豆中的各种可溶性蛋白质及糖分进行繁殖，并产生蛋白酶及其它酶类，同时完成前发酵过程。各曲样的游离态氮含量随时间的延长均有增加的趋势，并且都高于原料黑豆中游离态氮的含量0.24g/100g，说明菌种产生的胞外蛋白酶作用于黑豆的蛋白质并产生多肽或氨基酸，这些物质对豆豉的品质、风味以及营养影响较大，根据曲样的蛋白酶酶活以及曲样中游离态氮含量，分别选取在72h时酶活大于150U/g和游离态氮含量大于0.3g/100g的菌种，即选取D2、D8、D10、D16、D17号菌种进行豆豉制作。

表3 原料黑豆、纯种发酵豆豉成品和市购八宝豆豉主要成分的比较

表4 豆豉感官评定打分

图1 各曲样不同时间内蛋白酶活力以及游离态氮含量变化

2.2 豆豉制作

2.2.1 豆豉各项成分测定 为了筛选出适于豆豉生产的菌种，分别对复筛中的5株菌种接种黑豆制作豆豉，因5个菌种在产孢培养基培养后进行芽孢染色均有芽孢产生，故这些菌种均为芽孢杆菌，故选取后酵温度为45℃。表3给出了原料黑豆、纯种发酵大豆以及市售八宝豆豉的各主要成分，从表中可以看出各个菌种发酵后的豆豉蛋白质含量均有下降，但是氨基态氮、总酸以及灰分均比原料有很大的提高，这与李华等［7］研究的相符。与市购八宝豆豉相比，由于原料以及发酵条件不同，蛋白质含量较市购八宝豆豉高，游离态氮以及其它指标均接近于市购八宝豆豉，并且各菌种发酵的豆豉均符合豆豉行业标准SB82－1980中的规定。

2.2.2 感官评定结果 对制作的细菌型豆豉进行感官评定(表4)，根据评定结果，D2号菌制作出来的豆豉具有细菌型豆豉特有的酱香，浓郁绵长，并且滋味鲜美、软硬适中，为最优产品，对D2菌种进行鉴定。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 D2菌体菌落描述 D2菌种在显微镜下观察呈杆状(图2)，芽孢中生或端生，圆形或椭圆形，革兰氏染色为阳性。在固体培养基24h培养后菌落直径2.1mm左右(图2)，圆形，乳白色，表面褶皱，无光泽，边缘不整齐。试管液体中培养有菌膜，菌膜表面褶皱，无沉淀。

图2 D2菌种在显微镜以及LB培养基中形态特征

2.3.2 生理生化特征 以枯草芽孢杆菌为参照菌种，对D2号菌种进行部分生理生化特征的测定以及糖发酵实验，生理生化包括过氧化氢酶实验、对氧需求、V－P测定、明胶液化、淀粉水解、吲哚实验、硝酸盐还原、柠檬酸盐实验、葡萄糖产气实验;糖醇发酵包括葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇;并分别观察在2%、5%、7%、10%NaCl含量条件下菌种的生长情况，结果表明D2号菌种与参照菌种的生理生化特征相似。参考文献［3－5］中对枯草芽孢杆菌的描述以及生理生化特征，确定D2菌种为枯草芽孢杆菌。

2.3.3 菌株16S rDNA序列扩增 以菌株D2的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测得到一条大约1500bp的特异性条带，与预期的基因片段大小一致，如图3所示。

2.3.4 16S rDNA序列测定及分析 菌株 D2 16S rDNA序列扩增经测定，全长为 1436bp(登录号∶

图3 菌株16SrDNA PCR扩增结果

HQ221994)。将该序列通过BLAST进行同源序列检索发现，在亲缘关系相近的前100个序列中，99个为芽孢杆菌属的菌株，其中同源性最高的前10个菌株中有7个为枯草芽孢杆菌，D2菌株与它们都具有99%以上的相似性。其中与Bacillus subtilis(登录号∶GQ861470.1)的差异性最小，同源性水平最高。

根据16S rRNA序列同源性比对结果，选取来自核酸数据库上有代表性的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、苏云金芽孢杆菌 (B.thuringiensis)、巨大芽孢杆菌 (B.megaterium)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmu)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等9株芽孢杆菌的16S rDNA的序列与 D2菌种的16S rDNA序列以多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa，EU855214)作为一个单独的外群种用邻接法(Neighbor－Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建，结果见图4，分支上的数据为1000次重复获得的自展检验Boot strap值，由系统进化树可知，D2菌种与枯草芽孢杆菌 B.subtilis(登录号∶EU855214)落在同一分支，并且具有较高的自展值(boot strap value，100%)，与其它细菌均相距较远，表明D2菌种与B.subtilis的亲缘关系最近，结合该菌形态及生理生化特征初步判断该菌株属于枯草芽孢杆菌。

图4 D2菌种系统发育树状关系图(括号内为菌种的登录号)

3 讨论

豆豉的生产分为前酵(制曲)和后酵两个阶段，制曲阶段主要是利用菌种产酶，后酵则主要是利用微生物和酶的作用提高产品风味和增强保藏性［14］。豆豉中微生物产生的蛋白酶使蛋白质分解成胨、多肽、氨基酸等，这些物质不仅可以赋予产品鲜味，而且还利于消化吸收、具有多种生理功能［3］，故以高产蛋白酶菌种接种黑豆进行豆豉制作，制作出的产品不但符合豆豉产品的最终要求，而且还具有多种功能性成分。

本研究通过对高产蛋白酶菌种的筛选，经豆豉制作，综合豆豉理化指标以及感官评定筛选出一株优良菌种，并通对该菌种的生理生化以及分子检测，初步认为该菌种为枯草芽孢杆菌。而枯草芽孢杆菌作为一种安全多功能、无毒、无害的菌种［15］，已被广泛应用于食品以及医药卫生行业。

枯草芽孢杆菌能产生大量的淀粉酶和蛋白酶，是细菌型豆豉发酵过程中不可缺少的菌种［3］，目前用于豆豉发酵最多的是纳豆的生产，是利用枯草芽孢杆菌的一个亚种纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)作为发酵菌种的日本细菌型豆豉。而我国细菌型豆豉的制作由于没有明确菌体的菌种，生产过程及发酵均难以控制，并且还存在一定的安全隐患，故明确豆豉发酵菌种，并利用豆豉中优良菌种进行豆豉制作具有重要意义。

豆豉制曲期间游离态氮以及蛋白酶酶活随着制曲时间的延长而增加，当蛋白酶酶活达到一定值时，曲样的蛋白酶酶活开始下降。与其它芽孢杆菌相比，枯草芽孢杆菌更适合作为豆豉的发酵菌种。从豆豉中筛选高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌种，并纯种制作出的豆豉，符合豆豉行业标准的要求。

4 结论

采用酪蛋白平板初筛，制曲复筛，选取D2、D8、D10、D16、D17号菌种进行豆豉制作，经测定5种成品豆豉的理化指标均符合豆豉行业标准的要求，综合豆豉理化指标和感官评定认为D2号菌种蛋白酶产量高，发酵风味好。生理生化和16S rDNA序列分析结果鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。菌株 D2 16S rDNA序列经测定，全长为 1436bp(登录号∶HQ221994)，与Bacillus subtilis的差异性最小，同源性水平最高。该菌种源于豆豉，属于安全菌种，具有开发利用价值。

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Screening and identification of a strain for lobster sauce fermentation

LI Xiao－yong，CHEN Wei*，CHENG Fang，LI Jing
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China)

A bacteria producing high protease and suiting for fermenting lobster sauce from bacteria lobster sauce of Lin Yi was screened and identified.The result showed that five high－yield strains of protease were screened by casein plate and re－screened by starter making.According to the enzyme activity and free nitrogen’s content of startor of lobster sauce，five superior strains were used to ferment lobster sauce respectively.According to the sensory tests，physical and chemical indexes of five products，the Lobster Sauce fermented by D2 strain had a good flavor and the product was very delicious.Combining physiological characters and the sequence analysis of 16S ribosomal DNA，the strain D2 was preliminarily identified as Bacillus subtilis.The strain from lobster sauce was safe，therefore it was worth further studying and developing.

bacteria lobster sauce;isolation;identification;16S ribosomal DNA

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0212－05

2010－10－28 *通讯联系人

李小永(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:工业微生物发酵。