抗真菌乳酸菌的筛选鉴定及发酵特性

李红娟，刘鹭，张书文，孙卓，2，孔凡丕，吕加平

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.青岛农业大学食品科学学院，山东青岛266109）

抗真菌乳酸菌的筛选鉴定及发酵特性

李红娟1，刘鹭1，张书文1，孙卓1，2，孔凡丕1，吕加平1

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.青岛农业大学食品科学学院，山东青岛266109）

利用琼脂扩散法，对60株从传统乳酸菌发酵食品分离出来的乳酸菌进行抗真菌特性的筛选，得到一株抑菌性能较好的乳酸菌菌株AST18，经16s rDNA鉴定为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，并进一步对AST18发酵特性进行研究，研究表明AST18最适生长温度为37℃，培养基最适初始pH值为6.5，培养48 h以后抑菌物质生成量达到稳定。

抗真菌；乳酸菌；干酪乳杆菌；16s rDNA

0 引言

乳酸菌用在食品和饲料中有着悠久的历史，它可以降低食品pH值并产生抑菌的代谢物质,如对革兰氏阳性菌有良好抑制作用的乳酸链球菌素。近几年，国外许多研究发现乳酸菌对霉菌和酵母也有一定的抑菌功能，筛选出具有良好抑真菌性能的乳酸菌，并将其应用到食品中，有重要的实际应用价值。

本研究从中国传统发酵制品中分离出的乳酸菌中筛选出一株具有较好抑真菌作用的菌株AST18，经16s rDNA鉴定为干酪乳杆菌。并对该菌抗菌物质生成的发酵特性进行了研究，为抗真菌乳酸菌发酵剂研究开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养基

本研究中，所用乳酸菌菌株分离自东北泡菜及酸奶，指示菌Penicilliumsp.、momursp.、两株腐败酵母均分离自霉变干酪，啤酒酵母YS-1,YS-2,YS-3,YS-4,YS-5,YS-6,YS-7为本实验室提供，以上菌种均保存于中国农业科学院农产品加工研究所食品微生物实验室。

培养基为MRS培养基和PDA培养基。

1.1.2 乳酸菌无菌体发酵液制备

按2%的接种量，将活化后的乳酸菌接种于MRS液体培养基，37℃培养48 h，经离心(4 000 g，10 min)收集上清液。将上清液用0.22 μm无菌滤膜过滤。

1.1.3 霉菌孢子悬浮液制备

将Penicilliumsp.于PDA斜面培养基30℃培养7 d，直至孢子生成。用含有体积分数为0.05%吐温-80的无菌水冲洗斜面，用无菌纱布过滤，并利用血球计数板将孢子浓度调制为106mL-1。

1.2 方法

1.2.1 琼脂平板扩散法测定抑菌能力

将20 mL PDA培养基注入培养皿中，待凝固后将100 L制备好的霉菌孢子悬浮液涂布于培养基上，将牛津杯（直径8mm）轻置于平板上，静置5 min后取200 L无菌体发酵液注入牛津杯中。30℃培养2 d，测定抑菌圈直径[1]。

1.2.2 16S rDNA序列同源性鉴定乳酸菌菌株AST18

单菌落培养：将脱脂乳保存的菌种接于MRS肉汤培养基中，37℃培养18 h，在MRS琼脂平板中划线培养，使其长出单菌落。

变性：在MRS琼脂平板上挑取细菌于10 μL灭菌水中变性后离心取上清作为模板。反应条件为99℃（10 min）。

PCR扩增：采用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria细菌基因组DNA提取试剂盒提取AST18菌株基因组DNA，PCR扩增引物为上海宝生物技术有限公司所提供，引物序列如下：

Primers 16S.S(5_-GGTGTAGCGGGTGAAATGCGAA-3_)

16S.R(5_-CAGCCTACAATCCGAGCTGAG-3_)

使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)，进行PCR扩增目的片段。

PCR反应条件：PCR产物检测及纯化：预先制备1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取5 μL的PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压5 V/cm。电泳后，用溴化乙锭染色20～30 min，紫外灯下观察。如果PCR成功，则可见到约为1 500 bp的条带。采用宝生物公司的切胶回收试剂盒(TaKaRa Code：DV805A)纯化回收PCR扩增产物[2]。

测序：以上述序列为引物进行DNA测序。测序结果应用于BLAST程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的细菌16s rDNA序列进行相似性比较分析。

1.2.3 AST18抗菌物质生成发酵特性

（1）培养基初始pH值对抑菌物质生成的影响：用浓度为1 mol/L的HCl和NaOH将MRS肉汤培养基的初始pH值分别调至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。按质量分数为2%接种量接种，37℃培养48 h后观测抑菌圈大小、pH值及OD值[3]。

（2）培养温度对抑菌物质生成的影响：将初始pH值为6.5的MRS肉汤培养基按2%接种量分别在30，37及42℃培养48 h后，观测抑菌圈大小、pH值及OD值。

（3）通气条件对抑菌物质生成的影响：用250 mL锥形瓶37℃加不通气丁基橡胶胶塞静置培养，棉塞静置培养，棉塞摇床培养(转速130 r/min)，48 h观测pH值、OD值及抑菌活性[1]。

（4）最佳发酵时间的选择：将初始pH值为6.5的MRS肉汤培养基按2%接种量37℃恒温静置培养，在0，6，8，12，24，36，48，60，72 h测定抑菌圈大小、pH值及OD值。

2 结果分析

2.1 抗真菌乳酸菌的筛选

60株乳酸菌中有7株对Penicilliumsp.和momursp.同时显示出抑菌活性，Penicilliumsp.对乳酸菌发酵液相对momursp.敏感，定为试验指示菌。7株菌对从干酪中分得的腐败酵母及啤酒酵母均无抑制作用。其中AST18显示出最大抑菌活性，抑菌圈直径达20.83 mm。

表1 不同菌株48 h发酵液抑菌直径、OD值、pH值

2.2 AST18菌株16S rDNA序列同源性鉴定

PCR反应产物的检测与序列鉴定：预先制备1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取5 μL的PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压5 V/cm。电泳后，用溴化乙锭染色20～30 min，紫外灯下观察。见到约为1 500 bp的条带。采用宝生物公司的切胶回收试剂盒(TaKaRa Code：DV805A)纯化回收PCR扩增产物。

将PCR扩增产物用上述的引物进行DNA测序。用BLAST程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的细菌16s rDNA序列进行相似性比较分析。结果：AST18 1-600核苷酸序列与美国国家菌种保藏中心标准菌株干酪乳杆菌Lactobacillus caseiATCC 334同源性为99%。

2.3 AST18抗菌物质生成发酵特性研究

2.3.1 培养基初始pH值对抑菌物质生成的影响

用1 mol/L的HCl和NaOH将MRS肉汤培养基的初始pH值分别调至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。按质量分数为2%接种量接种，37℃培养48 h后观测抑菌圈大小、pH值及OD值。结果如图1所示。

由图1可以看出，AST18在培养基初始pH值在6.0～6.5之间，生长状况良好。且抑菌性能最佳。因此培养基初始pH值选为6.5。

2.3.2 培养温度对抑菌物质生成的影响

图1 不同初始pH值对OD值及抑菌直径的影响

将初始pH值为6.5的MRS肉汤培养基按质量分数为2%接种量分别在30，37及42℃培养48 h后，观测抑菌圈大小、pH值及OD值，结果如表2所示。

表2 不同培养温度的影响

由表2可以看出，AST18抑菌物质生成的最适温度为37℃，当温度升高到42℃时，AST18生长及抑菌物质的生成受到抑制。因此AST18最适生长温度为37℃。

2.3.3 通气条件对抑菌物质生成的影响

用250 mL锥形瓶37℃加不通气丁基橡胶胶塞静置培养，棉塞静置培养，棉塞摇床培养(100 r/min)，48 h观测pH值、OD值及抑菌活性，结果如表3所示。

表3 不同通气条件的影响

由表3可以看出，在摇床条件下，菌体抗菌代谢产物生成量较高，加不透气丁基橡胶塞菌AST18生长受抑制。棉塞摇床培养同棉塞静置培养的抑菌直径及OD值差异不显著。

2.3.4 最佳发酵时间的选择

将初始pH值为6.5的MRS肉汤培养基按质量分数为2%接种量37℃恒温静置培养，在0，6，8，12，24，36，48，60，72 h测定抑菌圈大小、pH值及OD值，结果如图2所示。

由图2可以看出，在发酵初期随时间的增加，菌量和抑菌活性都在增加，但在48 h时，抑菌活性达到最大值，后期发酵过程中随时间变化不明显，因此，最佳发酵时间选择48 h。

3 结论与讨论

霉菌和酵母几乎在任何食品上都可以生长：谷物、水果、蔬菜、坚果、乳制品等。O.Filtenborg等认为与各食品霉变相关的霉菌只有少量几种，大部分属于青霉、曲霉和镰刀霉。在酸奶和干酪等发酵乳制品中经常造成污染的霉菌主要是Penicillium commune和P.nalgiovense[4]。目前，生物防腐在延长食品货架期和加强食品安全方面起到了越来越重要的作用。生物防腐主要是通过自然发酵、添加发酵剂、或添加代谢产物来起到防腐保鲜的作用[5]。

乳酸菌自古以来就用于食品发酵和保藏，现在被视为公认安全微生物(GRAS)。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和双乙酰等抗菌物质外，还可产生一些具有抑菌或杀菌作用的细菌素，如乳链球菌素、片球菌素等，但大多数细菌素的抑菌谱较窄，如Nisin主要只对革兰氏阳性菌有抑制作用。近年来发现有些乳酸菌能产生另外一些广谱抗菌物质，苯乳酸就是其中之一[6]。

更进一步的研究发现菌株的抗真菌活力不仅仅与产生的有机酸有关，更是其它抗菌物质的联合作用[7]。只有少数乳酸菌能产生一系列的抗真菌物质，而大部分乳酸菌没有这个特性。因此推测这些菌株可能具有其独特的代谢途径[8]。

本研究中60株乳酸菌有7株对Penicilliumsp.和momursp.菌显示出一定程度的抑制活性，对其中抑菌性能最好的菌株AST18进行了鉴定，鉴定结果为干酪乳杆菌。并对其抑菌物质生成的发酵特性进行研究，研究表明AST18最适生长温度为37℃，培养基最适初始pH值为6.5，培养48 h以后抑菌物质生成量达到稳定。而对于抑菌物质具体活性成分需要进一步的研究。

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Screening of antifungalLactic acid bacteriaand the study of fermentation properties

LI Hong-juan1,LIU Lu1,ZHANG Shu-wen1,SUN Zhuo1,2,KONG Fan-pi1,LV Jia-ping1,
（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193 China，2.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109,China）

A total of 60Lactic acid bacteria(LAB)strains isolated from Chinese traditional fermented foods were screened for antifungal activity.The antifungal properties of AST18 which showed the highest antifungal activities among all the 60 strains were investigated.The AST18 was identified asLactobacillus caseiwith the 16s rDNA.The fermentation properties ofLactobacillus caseiAST18 were investigated.The optimum production of antifungal compound was at 37°C for 48 h and at the initial pH of 6.5.

antifungal;Lactic acid bacteria;Lactobacillus casei;16s rDNA

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）03-0004-03

2010-12-8

国家“十一五”奶业科技支撑计划项目（2006BAD04A07）。

李红娟（1987-），女，硕士研究生，研究方向为乳品微生物。

吕加平