miR-126对小鼠乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响

崔巍，王春梅，李庆章，冯丽，丁巍

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030)

miR-126对小鼠乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响

崔巍，王春梅，李庆章，冯丽，丁巍

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030)

应用脂质体转染技术，改变miR-126在小鼠乳腺上皮细胞中的表达量，采用qRT-PCR、HPLC、Western印迹等技术检测miR-126对小鼠乳腺上皮细胞的影响。结果显示，miR-126沉寂后，细胞增殖能力提高，β-酪蛋白表达增加，乳糖质量浓度增加，孕酮受体（PGR）表达增强。研究表明，miR-126可能通过抑制靶蛋白PGR表达，进而抑制乳腺上皮细胞增殖和泌乳量变化。

微小RNA；miR-126；孕酮受体（PGR）；基因沉寂

0 引言

一类通过翻译抑制调控基因表达的非编码RNA的发现，开启了哺乳动物细胞一种新的基因调控途径。包括人类的发育和衰老、神经疾病和癌症的治疗[1]。有研究证明miR-126与抑制乳腺癌细胞的增殖[2]及转移[3]有关。应用微阵列已分析出miR-126在小鼠乳腺生长发育不同时期表达差异，可能参与乳腺发育的调控[4]。利用miRBase方法预测分析，小鼠孕酮受体（progestrone receptor,PGR）mRNA存在与miR-126结合位点。为进一步阐释miR-126作用机制，本文拟从不同发育时期乳腺组织中鉴定miR-126差异性，对miR-126沉寂，在细胞水平检测PGR变化及对小鼠乳腺细胞发育及泌乳功能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性BALB/C小白鼠。X-tremeGene SiRNA Transfection Reagent；miR-126-3p inhibitor，Negative Control(N.C)，Hairpin-itTM microRNA qPCR Quantitation Kit，Trizol，Opti-MEM I medium，PGR多克隆抗体，GAPDH多克隆抗体，细胞角蛋白18抗体，SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ，辣根酶标记IgG，FITC二抗，ECL超敏发光液，CASY-ton缓冲液。

1.2 小鼠乳腺不同发育时期miR-126表达谱

针对小鼠不同发育时期乳腺组织，具体时间点进行取材，采用荧光定量的方法对小鼠乳腺发育、泌乳及退化中miR-126进行相对定量分析，同时验证基因芯片的结果。miR-126 RTprimer和PCR扩增引物均由上海吉玛公司合成。取不同时间点小鼠乳腺组织，提取总RNA，逆转录条件：16℃（30 min），42℃（30 min），85℃（10 min）。应用ABI 7500PCR仪，PCR条件：95℃（3 min），95℃（12 s），62℃（30 s）,40个循环。以5 s为内参。

1.3 小鼠乳腺上皮细胞培养与鉴定

取妊娠中期雌鼠乳腺组织，用胰蛋白酶37℃消化，再用I型胶原酶37℃继续消化，所得乳腺上皮细胞沉淀接种培养瓶中，于CO2培养箱中培养。细胞角蛋白18免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞角蛋白18的特异性表达[5]。

1.4 小鼠乳腺上皮细胞的瞬时转染

取对数生长期的小鼠乳腺上皮细胞，用培养基将其浓度调整为1.0×104细胞/mL，接种于培养板中，当细胞生长密度达到80%左右时，用miR-126 inhibitor和Negative Control分别转染小鼠乳腺上皮细胞，具体操作参见X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent说明书。实验分组如下：转染组：miR-126 inhibitor+X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent；阴性对照组：Negative Control+X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent；空白组。

1.5 小鼠乳腺上皮细胞活性测定

用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent进行转染，实验同1.4转染和阴性对照组，每组设3个平行，转染48 h后，消化收集各组细胞，CASY-ton缓冲液1︰100稀释后用CASY细胞分析仪检测活细胞数和细胞活力。

1.6 检测转然后细胞内miR-126相对变化

实验同1.4，分转染组和阴性对照组，每组3个平行，48 h后收获细胞，提取细胞中总RNA，应用qRTPCR技术检测miR-126的表达变化。

1.7 Westernblotting检测PGR蛋白

实验同1.4分，分3组，转染48 h后，分别收集以上各组小鼠乳腺上皮细胞，用2×SDS上样缓冲液提取细胞总蛋白，进行8%SDS-PAGE凝胶电泳并转膜，一抗为兔抗鼠PGR多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，ECL化学发光系统显示蛋白质表达，以GAPDH为内参，进行光密度分析。

Western blotting检测β-酪蛋白变化，实验同1.7。

1.8 HPLC检测乳糖质量浓度

实验分2组：转染组和阴性对照组，每组设3个平行，收集48 h的样品；色谱柱，十八烷基硅烷键合硅胶，F4.6 mm×150 mm；柱温，室温；紫外检测波长，195 nm；流动相，5%乙腈，经过0.22 μm滤膜过滤，超声脱气；流速，恒流0.6 mL/min；进样体积，10 μL。在同等条件下进行乳糖标准品的测定。

1.9 数据处理

荧光定量PCR的结果以Ct值显示，采用ΔΔCT法分析，计算相对定量结果（2-ΔΔCT）。采用SPSS13.0软件对相关实验数据进行t-检验分析，BandScand4.3软件对Western blotting图谱进行灰度扫描。

2 结果

2.1 不同发育时期小鼠乳腺组织miR-126表达谱

分别取青春4、5、7周，妊娠5、13、18日，泌乳3、7、13日、退化期2、5、10日乳腺组织，提取总RNA，甲醛变性电泳检测鉴定各时间点RNA质量，以逆转录cDNA为模板PCR，分别扩增miR-126和内参5 s，得出表达结果。miR-126在泌乳期相对变化较低（P＜0.01），其次是妊娠期（P＜0.01），青春7周相对变化最高（P＜0.01，图1）。

图1 qRT-PCR检测小鼠乳腺中miR-126的表达

图1中，依次为青春4周、5周、7周；妊娠5日、13日、18日；泌乳3日、7日、13日；退化2日、5日、10日。

2.2 抑制剂对内源miR-126表达影响

miR-126 inhibitor转染48 h后，经qRT-PCR检测，比较转染组、阴性对照组中miR-126的表达变化，结果显示miR-126在转染组表达量较阴性对照组显著降低（P＜0.01，图2）。

图2 qRT-PCR检测转染后miR-126表达

由图2可以看出，miR-126 inhibitor作用后内源性miR-126表达量显著减少，P＜0.01。

2.3 转染后对细胞活力的影响

miR-126 inhibitor转染48 h后，CASY细胞分析仪分析小鼠乳腺上皮细胞活性，转染组小鼠乳腺上皮细胞活性高于阴性对照组（P＜0.05，如表1），且差异显著，说明miR-126可抑制小鼠乳腺上皮细胞活性。

表1 miR-126 inhibitor作用后小鼠乳腺上皮细胞活性变化

2.4 转染后PGR蛋白表达变化

Western blotting技术检测转染组、阴性对照组和空白对照组小鼠腺上皮细胞中PGR蛋白表达的变化情况。结果显示在miR-126 inhibitor的作用下，小鼠乳腺上皮细胞中PGR蛋白的表达高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05，图3），说明miR-126可抑制小鼠乳腺细胞中PGR蛋白的表达。

图3(a)中，1为空白对照组；2为阴性对照组；3为抑制组；用miR-126 inhibitor和negative control分别转染小鼠乳腺上皮细胞；转染48 h后，应用Western blotting检测PGR蛋白的表达。图3(b)中，灰度扫描分析PGR的表达；通过3个平行实验获得实验数据；结果显示抑制组显著高于阴性对照组和空白对照组（means±SE,P＜0.05）。

图转染后蛋白表达变化

2.5 转染后β-酪蛋白表达变化

Western blotting技术检测转染组、阴性对照组和空白对照组小鼠腺上皮细胞中β-酪蛋白表达的变化情况。结果显示在miR-126 inhibitor的作用下，小鼠乳上皮细胞中β-酪蛋白的表达显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.01，如图4），说明miR-126可抑制小鼠乳腺细胞中β-酪蛋白的表达。

图4 转染后β-酪蛋白的变化

图4（a)中，1为抑制组；2为空白组；3为阴性对照组；用miR-126 inhibitor和negative control分别转染小鼠乳腺上皮细胞；转染48 h后，应用Western blotting检测β-酪蛋白的表达。图4(b)中，灰度扫描分析β-酪蛋白的表达；通过3个平行实验获得实验数据；结果显示抑制组显著高于阴性对照组和空白对照组（means±SE,P＜0.01）。

2.6 转染后乳糖质量浓度变化

根据乳糖标准曲线分析，并比较阴性对照组，结果显示，miR-126 inhibitor转染后乳糖质量浓度增加（P＜0.05，如图5），说明miR-126可抑制小鼠乳腺上皮细胞乳糖的分泌。

图5 转染后乳腺上皮细胞乳糖分泌变化

3 讨论

内含子miRNA代表着一种新的研究领域，在细胞系、斑马鱼、小鼠皮肤中内含子miRNA诱导的基因沉默证明，这种内含子介导的基因调控系统在真核生物中是高度保守的[1]。目前对miRNA功能研究主要集中在基因的调控和细胞发育及分化上。越来越多的证据显示，miRNA的失调与癌症相关[6-8]。研究发现，miR-126可以通过抑制肿块的生长，从而抑制高侵袭性乳腺癌细胞CN34的转移[3]。有试验表明，miR-126是通过抑制细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制了细胞的增殖[9]。在乳腺发育及泌乳的研究中发现，孕酮受体（PGR）基因仅在乳腺上皮组织中表达[10]，其表达调控也属于组织特异性激素调控[11]。PGR都存在A、B两种亚型，由同一基因编码，在没有怀孕和已经怀孕的成年小鼠乳腺中，PGR-A蛋白的表达水平超过PGR-B[12]。

本实验应用生物信息学、微阵列分析及荧光定量实验分析得出，miR-126结合靶基因PGR mRNA并进行调控，同时对小鼠乳腺上皮细胞的增殖和泌乳有着一定的抑制作用，并在翻译水平上影响靶蛋白，这为进一步研究miRNA在乳腺发育及泌乳功能方面的作用提供了一定的实验依据。

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Impact of miR-126 on proliferation and lactation of Mouse mammary epithelial cells

CUI Wei,WANG Chun-mei,LI Qing-zhang,FENG Li,DING Wei
(Key Laboratory of Dairy Science of Education Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this study,liposome transfection techniqueswere used to change the expression of miR-126 in mouse mammary epithelial cells.The effect of miR-126 on mouse mammary epithelial cells was analyzed by qRT-PCR,HPLC,Western blotting.The results showed that,after miR-126 silence cell proliferation ability enhanced,beta casein expression increased,lactose content increased,progesterone receptor(PGR)expression enhanced.The results suggest that miR-126 probably inhibit mammary epithelial cells and lactation by suppressing expression of PGR.

microRNA;miR-126;progestrone receptor;gene silencing

Q936

A

1001-2230（2011）03-0017-03

2010-12-13

国家自然科学基金（No.31072103）。

崔巍（1985-），女，硕士研究生，研究方向为乳腺发育与泌乳功能调控。

李庆章