蒋 虹,金 光,丛 喆,鲍琳琳,秦 川,魏 强
(中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京 100021)
奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对甲型H1N1流感病毒的抑制作用
蒋 虹,金 光,丛 喆,鲍琳琳,秦 川,魏 强
(中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京 100021)
目的 细胞水平测试奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对甲型流感H1N1病毒的抑制或杀伤作用。方法 通过在MDCK细胞系和甲型H1N1病毒株间建立药物剂量-效应关系确定导致细胞死亡的效力与抑制病毒复制的效力的比值(治疗指数),测试药物的抗病毒效果。结果 奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对MDCK细胞的半数中毒浓度分别为(1134.7±186.8)μg/mL、(742.0±76.9)μg/mL、(94.6±1.9)μg/mL,对甲型H1N1病毒的治疗指数(TI)分别为71.19、24.9和3.12。结论 奥司他韦对甲型H1N1病毒抑制作用最强,利巴韦林其次,盐酸金刚乙胺对甲型H1N1病毒抑制效果较弱。
病毒,甲型H1N1;奥司他韦;利巴韦林;盐酸金刚乙胺
奥司他韦(oseltamivir)别名:达菲是特异性抑制神经氨酸酶的活性,阻止病毒颗粒释放的一种最有效的抗流感病毒的药物,2002年下半年在中国上市,已广泛应用于临床治疗[1]。抗病毒化合物利巴韦林(ribavirin)又名病毒唑,是单磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)脱氢酶抑制剂,抑制IMP而阻碍病毒核酸合成的广谱强效的抗病毒药物[2]。盐酸金刚乙胺(rimantadine hydrochloride)为治疗和预防病毒性感冒的一线用药,对于流感的预防与早期治疗均有明显的效果[3]。但 2009年暴发“人感染猪流感”疫情,此次疫情的病原为变异后的新型甲型H1N1流感病毒,目前已在人类感染者体内发生变异,变异后的病毒对流感药物产生了明显的抗药性。世卫组织在09年7月首次收到关于大流行性流感病毒对奥司他韦具有耐药性的报告。随着世界许多地区流感活动增加[4],以及抗病毒药物的使用亦相应增多,这些事件的数量也在稳步增加。甲型H1N1A/California/7/09 病毒株[5,6]是 2009 年多区域检测到的动物源性的能够人与人传播的病毒株,我们选择奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺3种药物对甲型H1N1A/California/7/09体外抑制作用进行测试,对药物的抗病毒作用有一基本了解。
1.1 细胞和病毒
MDCK细胞(Madin Darby canine kidney)由中国医学科学院病原生物学研究所提供,细胞生长为含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U青链霉素的DMEM(Hyclone)培养液。
甲型H1N1-CA7(A/California/7/09)病毒,鸡胚尿囊液[7]。用 MDCK细胞扩增培养,维持液为DMEM培养液(Hyclone)含2%胎牛血清(Gbico)和终浓度 2 μg/mL TPCK。病毒半数细胞感染剂量(TCID50)为6.5。所有病毒操作在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全三级(ABSL-3)实验室进行。
1.2 测试药物
奥司他韦(达菲),批号090336,上海药物所提供。利巴韦林,四川百利药业有限责任公司提供。盐酸金刚乙胺,批号 Ky-Ru-MHA01,浙江普洛康制药有限公司提供。用维持液配制药物至5 μg/mL,作为药物毒性实验的起始浓度。0.2 μm滤器过滤除菌。
1.3 病毒滴定
甲型H1N1病毒接种于MDCK细胞96孔培养板中,34℃ 5%CO2培养3 d后观察细胞病变。弃上清液加入100 μL 0.5%中性红(Sigma),37℃避光作用1 h,PBS洗涤3次,每孔加入100 μL乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇)酶标仪540 nm读取吸光度值,计算病毒的半数感染剂量(TCID50)[8]。
1.4 药物对MDCK细胞毒性实验
药物毒性实验的起始浓度5 μg/mL,2倍系列稀释药物,加入到单层 MDCK细胞96孔培养板,37℃ 5%CO2培养,每天观察细胞病变。第5天培养板中加入CCK-8(同仁化学研究所公司),每孔10 μL,将培养板放于37℃ 5%CO2孵箱中3 h。酶标仪读板测定吸光度值波长为540 nm。按 Reed Muench计算药物对细胞的毒性浓度,最大无毒浓度(TD0),半数中毒浓度(TD50)。
1.5 药物抗病毒实验
长成单层的 MDCK细胞96孔培养板中,加入100 TCID50病毒,37℃ 5%CO2吸附 2 h,吸去病毒,受试药物用无血清DMEM培养基配制,从最大安全浓度起始 2倍系列稀释,加入到板中,34℃、5%CO2培养 3 d,观察细胞病变。去上清液,加入0.5% 中性红,每孔 100 μL,37℃ 5%CO2作用 1 h。弃去中性红,PBS(PH 7.2)洗涤3次,弃去96孔培养板中液体,加入乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇),每孔100 μL,室温放置15 min,540 nm 测定 A值。计算药物抑制病毒半数有效浓度(IC50)。
1.6 评价指标
药物对病毒的抑制率的曲线、药物对细胞50%毒性浓度与对病毒50%抑制浓度的比值(TC50/IC50)即治疗指数(therapeutic index,TI)[9,10]。
2.1 药物毒性
根据药物对MDCK细胞破坏率计算出药物半数中毒浓度和药物的安全浓度,奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺的半数中毒浓度分别为(1134.7±186.8) μg/mL、(742.0 ±76.9)μg/mL、(94.6 ±1.9)μg/mL(表1)对细胞的安全浓度分别为156.3 μg/mL 、78.1 μg/mL 、39.1 μg/mL。
2.2 药物对甲型H1N1病毒的抑制作用
奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺与100 TCID50甲型H1N1病毒作用,用细胞观察法和中性红测试细胞活性的方法获得药物对病毒的抑制率(图1)和药物抑制病毒半数有效浓度(IC50)(表1)。奥司他韦药物在对 MDCK细胞的安全浓度(156.3~19.5)μg/mL对病毒的抑制率达到80%以上,随后浓度到4.88 μg/mL仍有20%的抑制作用,治疗指数为71.19。利巴韦林浓度在(78.13~4.88)μg/mL之间对病毒的抑制作用80%逐渐递减,治疗指数为24.90。盐酸金刚乙胺对病毒的抑制率只有在浓度为78.3 μg/mL时达到50%,治疗指数为3.12。
图1 药物对甲型H1N1-CA7病毒的抑制率(A)奥司他韦、(B)利巴韦林、(C)盐酸金刚乙胺Fig.1 The inhibition rate of influenza A(H1N1)virus.(A)Oseltamivir phosphate,(B)Ribavirin,(C)Rimantadine hydrochloride
表1 药物对甲型H1N1病毒的抑制作用Tab.1 The inhibitory effects of compounds on H1N1-CA7 virus infection
三种药物对甲型 H1N1A/California/7/09病毒株在细胞水平抑制病毒的作用测试结果表明,奥司他韦抑制病毒作用强,治疗指数、安全性高。据报道,奥司他韦抑制神经氨酸酶的活性,具有特异性针对流感病毒释放的功效,体外实验证实与抗病毒类药物如利巴韦林、盐酸金刚乙胺相比,显示出明显的优势。虽然利巴韦林对甲型H1N1A病毒也有一定的抑制作用,但效果不如奥司他韦。盐酸金刚乙胺对甲型H1N1A病毒抑制效果较弱。三种药物通过细胞水平测试得到以上结果,但实际在人体内、动物体内的抗病毒作用因药物代谢作用不得而知,还应进行深入研究。
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Antiviral Activity of Oseltamivir Phosphate,Ribavirin and Rimantadine Hydrochloride on Influenza A/H1N1 Virus in Vitro
JIANG Hong,JIN Guang,CONG Zhe,BAO Lin-lin,QIN Chuan,WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine,Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models,State Administration of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100021,China)
Objective To evaluate the antiviral activity of oseltamivir phosphate,ribavirin and rimantadine hydrochloride on influenza A(H1N1)in vitro.Methods Drugs diluted in FCS-free DMEM media supplemented with 2 μg/mL TPCK-treated trypsin was applied to confluent MDCK cell monolayers for 1 h prior to addition of virus,at a challenge dose of one hundred times of the TCID50.The IC50of drugs were calculated using neutral red assay after 3 days treatment at 34℃.Results The therapeutic index(TI)of oseltamivir phosphate against influenza A(H1N1)virus was 61.90,ribavirin was 42.86,and rimantadine hydrochloride was 6.22.Ubenimex was lower than 1.00.Conclusions Influenza virus is sensitive to oseltamivir phosphate and ribavirin.The antiviral effect of rimantadine hydrochloride is significantly lower than that of oseltamivir phosphate and ribavirin.
Influenza A(H1N1)virus;Oseltamivir phosphate;Ribavirin;Rimantadine Hydrochloride
R33
A
1671-7856(2011)02-0023-03
2010-09-27
10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.06
北京市科技计划课题,编号:Z09000700090904。
蒋虹,女,研究方向:实验病毒学。
魏强,男,教授,博士生导师,研究方向:病毒学。