B亚型SHIVSF162p3中国恒河猴小剂量多次阴道黏膜感染

丛 喆，刘 浩，朵建英，王 卫，蒋 虹，高 虹，杨志伟，Sylvain Fleury，魏 强，秦 川

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

B亚型SHIVSF162p3中国恒河猴小剂量多次阴道黏膜感染

丛 喆1，刘 浩1，朵建英1，王 卫1，蒋 虹1，高 虹1，杨志伟1，Sylvain Fleury2，魏 强1，秦 川1

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

目的 模拟HIV性传播感染特点进行中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染研究，为我国艾滋病疫苗有效性评价提供新的模型构建思路。方法 选用20-30TCID50剂量的SHIVSF162p3病毒阴道黏膜途径感染六只成年雌性中国恒河猴，共感染13次，每次攻毒间隔4～7 d。采取测定血浆病毒载量和外周血CD4+∶CD8+。结果 6只中国恒河猴经13次病毒攻击后，经检测均建立系统性感染，血浆病毒载量呈阳性;CD4+∶CD8+均有下降。结论成功建立了中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染模型，为艾滋病研究提供了新的更接近于自然感染状态的模型建立模式。

猴-人免疫缺陷病毒(SHIV);模型，动物;黏膜感染

近年来，我国艾滋病流行趋势和特点发生了很大改变。2007年数据显示，性传播已经成为最主要的传播途径。严峻的流行形式和流行特点迫切需要研制出安全有效的艾滋病黏膜疫苗。随着艾滋病感染机制的深入研究，提倡建立模拟自然感染方式的动物模型进行候选疫苗的安全性、有效性以及免疫策略评价。因此，进行模拟HIV性传播特点的恒河猴黏膜感染研究显得非常迫切和重要。本文用致病性SHIVSF162p3按小剂量多次感染的方法经阴道途径连续接种中国恒河猴，分析感染模型病毒学、细胞学以及免疫学等方面的变化特点，为今后利用此黏膜模型进行艾滋病早期感染和发病机制以及疫苗和杀微生物剂有效性评价等研究提供相关实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

恒河猴 6 只，实验编号分别为 1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6。购自北京协尔鑫生物资源研究所(一级动物，合格证编号:SCXK(京)2005-0005)，用商品化膨化饲料饲养。体重4～6 kg。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光抗体检查法(IFA)检查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1、2、5)和猴 T淋巴细胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒(SIV)易感性密切相关的4种基 因 (Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17)筛查结果为阴性［1］。

1.2 感染毒株

感染毒株为SHIVSF162p3，由美国 NIH提供，中国恒河猴PBMCs滴定病毒原液 TCID50滴度为1×104TCID50/mL。

1.3 感染方法［2］

将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位，后肢抬高，暴露阴道口。用2 mL预冷的无菌PBS清洗阴道。再将稀释好的适当浓度的病毒液1 mL缓慢推入。实验猴保持此姿势30 min。

1.4 感染剂量和SHIVSF162p3感染猴血样的采集和处理

感染采取小量多次的方法，共感染13次。前6次使用20TCID50的SHIVSF162p3，后7次使用30TCID50的 SHIVSF162p3，间隔 4 ～ 7 d，即分别在 0、7、11、16、20、23、27、31、37、45、50、57 d 和 64 d 进行阴道感染。在每次感染前及13次感染结束后，即71、85、98、114、126、140、154、168、182、203、217 d 及 246 d采EDTA抗凝血3 mL，分别测定外周血 CD4+/CD8+比值及血浆病毒载量。

1.5 SHIVSF162p3感染猴血浆病毒载量的测定［3］

提取EDTA抗凝血浆中病毒 RNA，使用 SYBR green I实时荧光定量 RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

1.6 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定［4］

CD3-PerCP(BD，552851)、CD4-FITC(BD，550628)、CD8-PE(BD，557086)抗体标记 EDTA抗凝全血中淋巴细胞，流式细胞仪(Calibur FACS)测定CD4+/CD8+比值。根据 Facs Calibur测定的CD4+/CD8+比值、血常规结果，计算出 CD4+细胞绝对数。

2 结果

2.1 SHIVSF162p3感染猴外周血血浆病毒载量

6只实验猴都先后出现了血浆病毒载量。1-1感染后27 d出现载量，37 d达到高峰(6.498×107copies/mL)，57 d载量检测阴性消失，但在85 d载量再次出现，直至246 d载量一直都维持在105copies/mL左右。1-2病毒载量出现最早，初次感染后的23 d达到5.665×105copies/mL，27 d达到高峰(2.1×107copies/mL)，随后下降，至57 d检测呈阴性，共持续了4周时间，并且一直到第246 d都持续阴性。1-3和1-4的载量变化与2号相似，只是载量出现时间稍晚，1-3的载量出现在37 d，高峰期在45 d，也达到了107copies/mL的水平，但只维持了2周的时间;1-4比1-2晚4 d出现载量，出现时载量也已达到105copies/mL的水平，高峰期出现在31d(4.72×106copies/mL)，维持了3周左右的载量。不同的是，它们分别在感染后154 d和203 d出现一过性小幅反弹，载量水平只在103～104copies/mL之间。1-5和1-6的载量出现最晚，均出现在感染后50 d，并且不连续，没有明显的高峰，始终维持在104～106copies/mL的水平(图1)。

2.2 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值

图1 SHIVSF162p3小剂量多次阴道途径感染恒河猴血浆病毒载量结果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

6只实验猴的CD4+/CD8+比值在某一段时间内均有一个急剧下降的过程，总体有一个下降的趋势。1-1在感染后37 d CD4+/CD8+比值迅速从感染后31 d的1.51下降到0.50，并且持续走低，到300 d时，已降低到0.35。1-2和1-4总体没有太大的变化，但分别在感染后31 d和37 d有一个下降过程。1-2由27 d的3.89直降到1.55，其后又迅速回升，始终徘徊在3.0附近;1-4由2.72直降到1.69，并维持在这个水平上，只在182 d有一个小幅波动。1-3和1-5变化基本相同，分别在感染后45 d和64 d降到最低，并且出现倒置，其中 1-5甚至降到0.5以下，其后反弹并一直维持在0.8-1.0之间。1-6与1-3、1-5趋势相同，变化幅度小，没有出现倒置，始终维持在1.0以上，最低值1.02出现在85 d(图2)。

图2 SHIVSF162p3小剂量多次阴道途径感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值Fig.2 Changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

2.3 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+T细胞绝对数

所有实验猴的CD4+细胞绝对数在感染50 d内都基本保持稳定，在1 000个/μL全血上下浮动，随后均有逐步下降，但下降幅度不大，最低值始终在600以上(具体数据未显示)。只有1-1下降幅度较大，到感染后274 d时，已降到293个细胞/μL猴血(图 3)。

图3 SHIVSF162p3阴道途径感染恒河猴1-1外周血CD4+T细胞绝对数的变化Fig.3 The CD4+T cell counts(per 1 μL blood)in the Chinese-origin rhesus macaque 1-1 infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

3 讨论

流行病学调查显示，近年来，在世界范围内性传播是HIV-1感染的主要原因并且这种传播趋势仍呈上升状态。因此，阴道途径感染的恒河猴模型更能符合艾滋病感染的新趋势并成为当今关注的热点。在灵长类动物中，紧贴子宫阴道上皮的黏膜固有层中存在大量的郎格汉斯细胞(Langhans cell)，而这种细胞只表达CCR5受体而不表达CXCR4受体。因此，作为单一CCR5受体特异性的SHIVSF162p3病毒的生物学优势显现出来，成为目前国际上应用比较多的黏膜途径感染用SHIV病毒。而小剂量多次感染也由于更接近人的自然感染状态，成为目前一种比较新颖的攻毒策略。

本研究中我们使用 Cecilia教授提供的SHIVSF162p3，并采用小剂量连续多次阴道感染的策略，感染6只中国恒河猴，共攻毒13次，前6次剂量为20TCID50，后 7次为 30TCID50，比 Cecilia教授等使用的50TCID50要低一倍左右［5］。第一只动物阳转是在第6次攻毒后，到13次攻毒结束后，6只实验猴已全部被感染。所有实验猴的病毒载量高峰都达到了106copies/mL～107copies/mL，并且病毒载量的峰值和CD4+/CD8+的低值之间是一一对应的，尤其是出现较早的1-1到1-4，这和 Cecilia等人采用小剂量连续多次阴道感染印度恒河猴的实验数据是基本相同的，只是载量的峰值略高一个数量级(Cecilia教授感染印度恒河猴的载量高峰在105copies/mL～106copies/mL之间)。并且除1-1以外，其它实验猴外周血中CD4+T细胞绝对数没有大的变化，这一点也与Cecilia教授观察到的结果相同。但1-1出现的持续的CD4+T细胞绝对数的下降，并且接近200个/μL这一现象还是很值得我们注意。通常情况下我们认为R5嗜性的SHIV并不如CXCR4嗜性的病毒那样容易引起CD4+T细胞的耗竭［4］，尤其是在中国恒河猴中。1-1出现这样的现象是何种因素造成的，还需要我们进一步的观察与分析。

与小剂量多次攻毒所产生的多载量峰值的现象不同，Lily等［6］人采用一次大剂量(103.7TCID50SHIVSF162p3)阴道攻毒后，4只恒河猴病毒载量峰值都达到了106copies/mL～108copies/mL，其中两只猴病毒载量 set-point值维持在(105～107)copies/mL直至死亡，它们的外周血CD4+T细胞绝对数也出现较明显的下降。尸检结果表明两只恒河猴均死于SAIDS。这个结果从一个侧面说明了 SHIVSF162p3具有较强的致病性。

本次研究中，我们没有使用NIH提供的病毒的TCID50来进行中国恒河猴的SHIVSF162p3的攻毒，而是使用中国恒河猴PBMCs进行了重新滴定。这样一方面了解了病毒对中国恒河猴PBMCs细胞的感染特性，同时也消除了运输途中，可能的温度变化导致病毒毒力的降低。在小剂量攻击的模型中，由于病毒剂量小，所以滴定的微小误差可能导致模型的成败。因此TCID50结果的准确对小剂量攻击模型来说是至关重要的。

SHIVSF162p3小剂量连续多次阴道感染模型除了可以较好的模拟HIV-1疾病过程，也很适合进行以包膜为基础的疫苗效用可行性评估。当然，这并不意味着这一病毒无懈可击。由于R5-SHIVSF162p3所包含的HIV片段为欧美流行株HIV B亚型片段，而目前中国HIV流行株绝大多数为C亚型［7］，所以这并不完全适合评价针对我国HIV流行特点设计的艾滋病疫苗。但是，通过对R5-SHIVSF162p3的构建和生物学研究，为构建适合评价我国艾滋病疫苗的SHIV病毒提供了借鉴。

［1］刘秀英，丛喆，侯俊，等.中国恒河猴 Mamu-A*01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应［J］.中国实验动物学报，2008，16(2):100－104.

［2］冯育芳，王卫，许琰，等.SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究［J］.中国比较医学杂志，2007，17(2):80－83.

［3］丛喆，李兆忠，魏强，等.SYBR Green I实时荧光定量 RTPCR测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数方法的建立［J］.中国实验动物学报，2006，14(4):271－275.

［4］王卫，刘强，许琰，等.SHIV-KB9感染中国恒河猴有效浓度的确定［J］.中国比较医学杂志，2007，17(2):67－71.

［5］Harouse JM， GettieA， Cheng-MayerC， etal. Mucosal transmission and induction of simian AIDS by CCR5-specific simian/human immunodeficiency virus SHIVSF162P3［J］.J Virol，75(4):1990– 1995.

［6］Tsai L，Trunova N，Cheng-Mayer C，et al.Efficient repeated low-dose intravaginal infection with X4 and R5SHIVs in rhesus macaque:Implications for HIV-1 transmission in humans［J］.Virology，2007，362(1):207– 216.

［7］Wu Z，Sun X，Sullivan SG，et al.Public health.HIV testing in China［J］.Science，2006，312(5779):1475-1476.

Efficient Repeated Low-Dose Intravaginal Infection with SHIVSF162p3in Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，LIU Hao1，DUO Jiang-ying1，WANG Wei1，JIANG Hong1，GAO Hong1，YANG Zhi-wei1，Sylvain Fleury2，WEI Qiang1，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

ObjectiveNonhuman primate models are increasingly used in the screening of candidate AIDS vaccines and immunization strategies for advancement to large-scale human trials.The predictive value of such macaque studies is largely dependent upon the fidelity of the model system in mimicking human immunodeficiency virustype 1(HIV-1)infection in terms of viral transmission，replication，and pathogenesis.The aim of this study was to establish a Chineseorigin rhesus monkey model of CCR5-specific chimeric simian/human immunodeficiency virus(SHIVSF162p3)infection，induced by repeated low-dose intravaginal infection，and explore whether this new chimeric model could be more efficient inAIDS vaccine research.MethodsTotally 6 female Chinese-origin rhesus monkeys were enrolled in this study.All animals were intra-vaginally challenged 13 times with 1 mL of a phosphate buffered virus solution containing the heterologous SHIVSF162p3，with 20 TCID50for the first 7 challenges and 30 TCID50for the remaining 6 challenges.Challenges were done every 4-7 days.Whole blood was collected and plasma virus was quantified by real-time SYBR green RT-PCR and T cell subsets were determined by flow cytometry analysis.ResultsSystemtic infection was successfully established in 6 Chinese-origin rhesus macaques after 13 challenges.The peak of viral loads was between 106copies/mL to 108copies/mL，wherease their CD4+/CD8+ratio was decreased.Conclusions The results of this study provide a firm basis for establishing a Chinese rhesus macaques model of SHIV infection by repeated low dose of SHIVSF162p3，a route more close to natural way of AIDS infection.This model would be very useful for HIV-1 subtype B vaccine and pathogenesis studies.

SHIV;Animal model;vaginal transmission;Chinese-origin rhesus monkey

R33

A < class="emphasis_bold"> 【文章编号】1

1671-7856(2011)02-0044-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.10

国家十一五科技重大专项课题 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(DWS 201009)。

丛喆，硕士，主管技师，从事实验动物病毒分子生物学和模型研究工作。

秦川，教授，博士生导师，研究方向:分子病理学，疾病模型。E-mail:Qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-08